苦马豆素诱导山羊黄体细胞凋亡的信号转导通路研究
发布时间：2023-11-27 19:07
苦马豆素（1，2，8-trihyroxyindolizidine，swainsonine，SW）是从豆科黄芪属（Astrgalus）和棘豆属（Oxytropis）等有毒植物中分离得到的一种吲哚兹定生物碱。家畜采食含有SW的植物后不仅能导致中毒死亡，更为严重的是还能引起母畜不孕或流产，给予畜牧业造成巨大的经济损失。到目前为止，关于SW是如何引起妊娠母畜流产的分子机制还不清楚。近年来的研究显示，许多有毒物质是通过诱导黄体细胞凋亡来影响其孕酮分泌进而导致动物不孕或流产。因此，本论文在建立永生化山羊黄体细胞系的基础上，进行SW对山羊黄体细胞孕酮分泌的影响和SW诱导山羊黄体细胞凋亡的信号转导通路研究，以期揭示SW引起妊娠母畜流产的分子机制。研究得到以下结果： 1.采取妊娠6～8周的山羊黄体组织，用2mg/mL的胶原酶消化分离黄体细胞，离心收集消化后分散的单个细胞或细胞团，用含有10%胎牛血清的DMEM/DF12培养基悬浮细胞沉淀，置于37oC、5%CO2培养箱中培养。接种培养12h后细胞开始贴壁，呈梭形和多角形，为原代山羊黄体细胞。细胞化学染色显示3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-hydroxyst...
【文章页数】：109 页
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
文献综述
第一章 黄体细胞永生化研究进展
1.1 黄体细胞的形态特征
1.2 黄体细胞的功能
1.2.1 孕酮的合成与分泌
1.3 孕酮合成的调节
1.3.1 促黄体激素对孕酮合成分泌的调节
1.3.2 生长激素和胰岛素生长因子-I 对孕酮合成分泌的调节
1.3.3 前列腺素对孕酮合成分泌的影响
1.4 原代黄体细胞的分离培养
1.4.1 原代黄体细胞的增殖和衰老
1.4.2 衰老与端粒的关系
1.4.3 端粒酶的结构与功能
1.5 细胞的永生化
1.5.1 促使细胞永生的基本方法
1.6 黄体细胞系
1.7 端粒酶在细胞永生化中的优越性
第二章 植物生物碱诱导细胞凋亡的研究进展
2.1 细胞凋亡
2.1.1 凋亡与坏死
2.1.2 细胞凋亡的特征
2.1.3 细胞凋亡的调控
2.1.4 Caspase 家族
2.1.5 Bcl-2 蛋白家族
2.1.6 线粒体相关凋亡分子
2.2 细胞凋亡的生理意义
2.3 细胞周期与调控
2.4 植物生物碱诱导的细胞凋亡
2.4.1 苦参碱
2.4.2 粉防已碱
2.4.3 秋水仙碱
2.4.4 石蒜碱
2.4.5 千金藤碱
2.4.6 喜树碱
2.4.7 玫瑰树碱
2.5 苦马豆素
2.5.1 苦马豆素的来源和性质
2.5.2 SW 引起家畜中毒的临床表现与病理变化
2.5.3 苦马豆素的作用
2.5.4 苦马豆素诱导细胞凋亡作用
2.6 本研究的目的和意义
试验研究
第三章 永生化山羊黄体细胞系的建立及其生物学特征分析
3.1 材料
3.1.1 细胞和菌株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 试验所用溶液及其配制
3.1.4 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 山羊黄体细胞的分离培养
3.2.2 黄体细胞的鉴定
3.2.3 hTERT 基因转染原代山羊黄体细胞
3.2.4 黄体细胞的纯化及鉴定
3.2.5 外源性 hTERT 在转染后黄体细胞中的表达和活性
3.2.6 转染后黄体细胞生物学功能的检测
3.2.7 转染后黄体细胞生物学特征的检测
3.2.8 统计学分析
3.3. 结果
3.3.1 原代黄体细胞的分离培养和鉴定
3.3.2 pCI-neo-hTERT 质粒的提取
3.3.3 G418 对山羊黄体细胞最佳筛选浓度的确定
3.3.4 转染后阳性细胞的挑取
3.3.5 黄体细胞的纯化和鉴定
3.3.6 hTERT 基因在黄体细胞中的表达和活性检测
3.3.7 RT-PCR 检测转染后黄体细胞内关键基因的表达
3.3.8 放射免疫检测不同刺激物对转染后黄体细胞孕酮分泌量的影响
3.3.9 转染前后黄体细胞生长曲线的测定
3.3.10 转染前后黄体细胞凋亡检测
3.3.11 转染前后黄体细胞核型分析
3.3.12 软琼脂悬浮试验
3.3.13 裸鼠致瘤性试验
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 苦马豆素对黄体细胞孕酮分泌和细胞活性的影响
4.1 材料
4.1.1 SW 与细胞株
4.1.2 主要试剂
4.1.3 试验所用溶液及其配制
4.1.4 主要仪器
4.2 方法
4.2.1 SW 对黄体细胞孕酮分泌的影响
4.2.2 SW 对黄体细胞活性的影响
4.2.3 QRT-PCR 检测 SW 对黄体细胞内 StAR，3β-HSD 和 P450scc 表达
4.2.4 Western blot 检测 SW 对黄体细胞内 StAR，3β-HSD 和 P450scc 表达
4.2.5 流式细胞仪检测 SW 处理后黄体细胞周期分布
4.2.6 Annexin-V FITC/PI 双标检测细胞凋亡率
4.2.7 DNA 片段化分析
4.2.8 统计学分析
4.3 结果
4.3.1 不同浓度 SW 对黄体细胞孕酮分泌的影响
4.3.2 不同浓度 SW 对黄体细胞活性的影响
4.3.3 建立检测 StAR，3β-HSD 和 P450scc 基因的 QRT-PCR 方法
4.3.4 SW 对转染后黄体细胞内表达 StAR 的影响
4.3.5 SW 对转染后黄体细胞内表达 P450scc 的影响
4.3.6 SW 对转染后黄体细胞内表达 3β-HSD 的影响
4.3.7 SW 对转染后黄体细胞周期的影响
4.3.8 SW 对转染后黄体细胞 G0/G1 周期蛋白的影响
4.3.9 SW 诱导转染后黄体细胞凋亡
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 苦马豆素诱导山羊黄体细胞凋亡的信号通路
5.1 材料
5.1.1 SW 与所使用细胞
5.1.2 主要试剂
5.1.3 试验所用溶液及其配制
5.1.4 主要仪器
5.2 方法
5.2.1 SW 对黄体细胞形态的影响
5.2.2 SW 对黄体细胞内 Caspase-8，-9 和-3 的活性的影响
5.2.3 Annexin-V FITC/PI 双标检测 SW 对原代黄体细胞凋亡率的影响
5.2.4 DNA 片段化分析
5.2.5 Western blot 检测
5.2.6 QRT-PCR 检测 SW 对黄体细胞内 Bax 和 Bcl-2 mRNA 表达的变化
5.2.7 统计学分析
5.3 结果
5.3.1 SW 对转染后黄体细胞形态，Caspase 活性和 PARP 表达的影响
5.3.2 Caspase 级联反应在 SW 诱导转染后黄体细胞凋亡中的作用
5.3.3 SW 对转染后黄体细胞内 Bcl-2 和 Bax mRNA 表达的影响
5.3.4 SW 对转染后黄体细胞内 Fas，FasL，Bax 和 Bcl-2 表达的影响
5.3.5 SW 对转染后黄体细胞内 Bax，Cyt c，AIF 和 Smac 转位的影响
5.3.6 SW 对原代黄体细胞的诱导凋亡作用
5.3.7 Caspase 级联反应在 SW 诱导原代黄体细胞凋亡中的作用
5.3.8 SW 对原代黄体细胞内 Bax 和 Bcl-2 表达的影响
5.3.9 SW 对原代黄体细胞 Cyt c 转位的影响
5.4 讨论
5.5 小结
结论与创新点
参考文献
主要缩略词和中英文对照表
致谢
作者简介
本文编号：3868398
【文章页数】：109 页
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
文献综述
第一章 黄体细胞永生化研究进展
1.1 黄体细胞的形态特征
1.2 黄体细胞的功能
1.2.1 孕酮的合成与分泌
1.3 孕酮合成的调节
1.3.1 促黄体激素对孕酮合成分泌的调节
1.3.2 生长激素和胰岛素生长因子-I 对孕酮合成分泌的调节
1.3.3 前列腺素对孕酮合成分泌的影响
1.4 原代黄体细胞的分离培养
1.4.1 原代黄体细胞的增殖和衰老
1.4.2 衰老与端粒的关系
1.4.3 端粒酶的结构与功能
1.5 细胞的永生化
1.5.1 促使细胞永生的基本方法
1.6 黄体细胞系
1.7 端粒酶在细胞永生化中的优越性
第二章 植物生物碱诱导细胞凋亡的研究进展
2.1 细胞凋亡
2.1.1 凋亡与坏死
2.1.2 细胞凋亡的特征
2.1.3 细胞凋亡的调控
2.1.4 Caspase 家族
2.1.5 Bcl-2 蛋白家族
2.1.6 线粒体相关凋亡分子
2.2 细胞凋亡的生理意义
2.3 细胞周期与调控
2.4 植物生物碱诱导的细胞凋亡
2.4.1 苦参碱
2.4.2 粉防已碱
2.4.3 秋水仙碱
2.4.4 石蒜碱
2.4.5 千金藤碱
2.4.6 喜树碱
2.4.7 玫瑰树碱
2.5 苦马豆素
2.5.1 苦马豆素的来源和性质
2.5.2 SW 引起家畜中毒的临床表现与病理变化
2.5.3 苦马豆素的作用
2.5.4 苦马豆素诱导细胞凋亡作用
2.6 本研究的目的和意义
试验研究
第三章 永生化山羊黄体细胞系的建立及其生物学特征分析
3.1 材料
3.1.1 细胞和菌株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 试验所用溶液及其配制
3.1.4 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 山羊黄体细胞的分离培养
3.2.2 黄体细胞的鉴定
3.2.3 hTERT 基因转染原代山羊黄体细胞
3.2.4 黄体细胞的纯化及鉴定
3.2.5 外源性 hTERT 在转染后黄体细胞中的表达和活性
3.2.6 转染后黄体细胞生物学功能的检测
3.2.7 转染后黄体细胞生物学特征的检测
3.2.8 统计学分析
3.3. 结果
3.3.1 原代黄体细胞的分离培养和鉴定
3.3.2 pCI-neo-hTERT 质粒的提取
3.3.3 G418 对山羊黄体细胞最佳筛选浓度的确定
3.3.4 转染后阳性细胞的挑取
3.3.5 黄体细胞的纯化和鉴定
3.3.6 hTERT 基因在黄体细胞中的表达和活性检测
3.3.7 RT-PCR 检测转染后黄体细胞内关键基因的表达
3.3.8 放射免疫检测不同刺激物对转染后黄体细胞孕酮分泌量的影响
3.3.9 转染前后黄体细胞生长曲线的测定
3.3.10 转染前后黄体细胞凋亡检测
3.3.11 转染前后黄体细胞核型分析
3.3.12 软琼脂悬浮试验
3.3.13 裸鼠致瘤性试验
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 苦马豆素对黄体细胞孕酮分泌和细胞活性的影响
4.1 材料
4.1.1 SW 与细胞株
4.1.2 主要试剂
4.1.3 试验所用溶液及其配制
4.1.4 主要仪器
4.2 方法
4.2.1 SW 对黄体细胞孕酮分泌的影响
4.2.2 SW 对黄体细胞活性的影响
4.2.3 QRT-PCR 检测 SW 对黄体细胞内 StAR，3β-HSD 和 P450scc 表达
4.2.4 Western blot 检测 SW 对黄体细胞内 StAR，3β-HSD 和 P450scc 表达
4.2.5 流式细胞仪检测 SW 处理后黄体细胞周期分布
4.2.6 Annexin-V FITC/PI 双标检测细胞凋亡率
4.2.7 DNA 片段化分析
4.2.8 统计学分析
4.3 结果
4.3.1 不同浓度 SW 对黄体细胞孕酮分泌的影响
4.3.2 不同浓度 SW 对黄体细胞活性的影响
4.3.3 建立检测 StAR，3β-HSD 和 P450scc 基因的 QRT-PCR 方法
4.3.4 SW 对转染后黄体细胞内表达 StAR 的影响
4.3.5 SW 对转染后黄体细胞内表达 P450scc 的影响
4.3.6 SW 对转染后黄体细胞内表达 3β-HSD 的影响
4.3.7 SW 对转染后黄体细胞周期的影响
4.3.8 SW 对转染后黄体细胞 G0/G1 周期蛋白的影响
4.3.9 SW 诱导转染后黄体细胞凋亡
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 苦马豆素诱导山羊黄体细胞凋亡的信号通路
5.1 材料
5.1.1 SW 与所使用细胞
5.1.2 主要试剂
5.1.3 试验所用溶液及其配制
5.1.4 主要仪器
5.2 方法
5.2.1 SW 对黄体细胞形态的影响
5.2.2 SW 对黄体细胞内 Caspase-8，-9 和-3 的活性的影响
5.2.3 Annexin-V FITC/PI 双标检测 SW 对原代黄体细胞凋亡率的影响
5.2.4 DNA 片段化分析
5.2.5 Western blot 检测
5.2.6 QRT-PCR 检测 SW 对黄体细胞内 Bax 和 Bcl-2 mRNA 表达的变化
5.2.7 统计学分析
5.3 结果
5.3.1 SW 对转染后黄体细胞形态，Caspase 活性和 PARP 表达的影响
5.3.2 Caspase 级联反应在 SW 诱导转染后黄体细胞凋亡中的作用
5.3.3 SW 对转染后黄体细胞内 Bcl-2 和 Bax mRNA 表达的影响
5.3.4 SW 对转染后黄体细胞内 Fas，FasL，Bax 和 Bcl-2 表达的影响
5.3.5 SW 对转染后黄体细胞内 Bax，Cyt c，AIF 和 Smac 转位的影响
5.3.6 SW 对原代黄体细胞的诱导凋亡作用
5.3.7 Caspase 级联反应在 SW 诱导原代黄体细胞凋亡中的作用
5.3.8 SW 对原代黄体细胞内 Bax 和 Bcl-2 表达的影响
5.3.9 SW 对原代黄体细胞 Cyt c 转位的影响
5.4 讨论
5.5 小结
结论与创新点
参考文献
主要缩略词和中英文对照表
致谢
作者简介
本文编号：3868398
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3868398.html
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