EDN3在不同毛色绵羊皮肤中的表达及其对色素细胞影响的研究

发布时间：2017-05-22 21:22

  本文关键词：EDN3在不同毛色绵羊皮肤中的表达及其对色素细胞影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：哺乳动物体表由皮肤及被毛覆盖,其中毛色的深浅变化及颜色差异受到外界环境,营养摄入,基因遗传等的影响,但黑色素合成的多少直接决定毛发的颜色。在色素相关研究中发现内皮素(Endothelin, EDN)作为一类由角化细胞合成的旁分泌因子,对未成熟的黑色素细胞主要发挥促分化并影响迁移的作用,对成熟的黑色素细胞则以刺激增殖分裂为主。尽管如此,对绵羊被毛黑色素合成的影响尚未见报道,对不同色素细胞的影响仍有待研究。本研究以不同毛色绵羊及不同的黑色素细胞为研究对象,运用多种生物学方法探索EDN3在绵羊不同毛色形成过程中的作用机制及其对色素生成的调控作用。(1)实时荧光定量PCR技术分析在不同毛色绵羊皮肤中EDN3的相对表达量,结果显示：全白绵羊皮肤中EDN3的表达量是黑色绵羊皮肤(黑白花斑绵羊)的4.8倍,是全黑绵羊皮肤表达量的5.5倍;绵羊白色皮肤(黑白花斑绵羊)EDN3的表达量是黑色皮肤(黑白花斑绵羊)的3.8倍,是全黑绵羊皮肤表达量的4.3倍。数据分析结果显示EDN3 mRNA在不同毛色绵羊皮肤中的表达差异极显著(P0.01)。(2)通过ELISA检测EDN3在不同毛色绵羊皮肤中的蛋白表达量,结果显示：全白绵羊皮肤中EDN3的表达量是黑色皮肤(黑白花斑绵羊)的4.5倍,是全黑绵羊皮肤表达量的5.1倍；白色皮肤(黑白花斑绵羊)EDN3的表达量是黑色皮肤(黑白花斑绵羊)的3.3倍,是全黑绵羊皮肤的3.7倍。EDN3在白色绵羊皮肤与黑色绵羊皮肤的蛋白表达差异极显著(P0.01)。(3)EDN3蛋白定位表达的结果可知,不同毛色绵羊皮肤的毛囊中有EDN3的正常表达,根据阳性反应颜色的深浅可判断EDN3主要表达部位为毛基质,内毛根鞘和外毛根鞘等处。(4)运用MTT法检测不同来源的黑色素细胞在不同浓度EDN3(10-10mol/L、10-9 mol/L、10-8mol/L、10-7 mol/L、10-6mol/L)影响下的增殖率。结果显示两种来源的黑色素细胞在EDN3的刺激下增值率均有所提高,但以EDN3浓度为10-8mol/L时细胞增殖率的提高达到了顶峰,随后浓度过高时(10-7,10-6)反而会对增殖率的提升产生了部分的抑制作用。比较两种细胞的增值率显示白色皮肤来源的黑色素细胞在EDN3为10-8mol/L时的增殖率明显高于黑色皮肤来源的黑色素细胞。(5)实时荧光定量PCR技术检测EDN3在10-8mol/L浓度时EDNRB、NRas、TYR基因mRNA相对表达量的变化。结果显示：添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB mRNA的相对表达量是正常细胞组的1.7992倍,NRas是正常细胞组的1.8536倍差异极显著(P0.01),但TYR的表达量与正常组细胞相比几乎未发生变化;添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB mRNA的相对表达量是正常细胞组的2.2512倍,NRas是正常细胞组的1.3859倍,TYR是正常细胞组的15.5710倍差异极显著(P0.01)。(6) Western Blot检测EDNRB、NRas、TYR蛋白表达的结果显示：添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB蛋白表达量是正常细胞组的3.0827倍差异极显著(P0.01),NRas是正常细胞组的1.2936倍差异显著(P0.05), TYR蛋白表达量未发生明显变化;添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB蛋白表达量是正常细胞组的3.9800倍差异极显著(P0.01), NRas是正常细胞组的1.3658倍差异显著(P0.05), TYR是正常细胞组的1.8498倍差异显著(P0.05)。上述结果显示：EDN3在不同毛色绵羊皮肤中均可正常表达,且表达量存在显著的差异。EDN3促进白色来源的黑色素细胞增殖但对色素合成的限速酶TYR未产生促进作用；EDN3促进黑色来源的黑色素细胞增殖并可能促进黑色素生成。
【关键词】：EDN3 绵羊 黑色素细胞 黑色素
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要7-9
• 前言9-11
• 文献综述11-16
• 1 色素研究现状11-13
• 1.1 黑色素细胞的发育11-12
• 1.2 黑色素的合成12-13
• 1.3 黑色素生成的调节13
• 2 EDN3研究进展13-15
• 2.1 EDN3主要功能及作用13-14
• 2.2 EDN3与色素沉着14-15
• 3 本研究的意义和内容15-16
• 实验一 EDN3在不同毛色绵羊皮肤的表达与定位16-25
• 1 实验材料16
• 1.1 实验动物与材料16
• 1.2 主要仪器与试剂16
• 2 实验方法16-20
• 2.1 RNA的提取16-17
• 2.2 cDNA的合成17
• 2.3 设计引物及PCR扩增17-18
• 2.4 qRT-PCR的扩增18-19
• 2.5 总蛋白的提取19
• 2.6 ELISA蛋白含量测定19
• 2.7 免疫组织化学19-20
• 3 结果20-25
• 3.1 PCR扩增电泳结果20-21
• 3.2 EDN3 mRNA的表达差异21-22
• 3.3 ELISA试验结果22
• 3.4 免疫组化结果22-25
• 实验二 EDN3对不同毛色绵羊黑色素细胞的影响25-35
• 1 实验材料与主要试剂25-26
• 1.1 材料25
• 1.2 主要仪器25
• 1.3 实验试剂25-26
• 2 实验方法26-29
• 2.1 黑色素细胞的复苏与传代26
• 2.2 黑色素细胞活力的测定26
• 2.3 Real-time PCR检测26-27
• 2.4 提取细胞总蛋白27
• 2.5 Western Blot27-28
• 2.6 Western Blot结果分析28-29
• 3 结果29-35
• 3.1 黑色素细胞的形态学观察29
• 3.2 EDN3对细胞增殖率的影响29
• 3.3 EDNRB、NRas及TYR mRNA的变化29-33
• 3.4 Western blotting实验结果33-35
• 讨论35-38
• 1 EDN3在不同毛色绵羊皮肤的表达与定位35-36
• 2 EDN3对不同毛色绵羊黑色素细胞的影响36-38
• 全文结论及创新点38-39
• 参考文献39-43
• Abstract43-45
• 附录45-47
• 致谢47

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1 李亚楠;EDN3在不同毛色绵羊皮肤中的表达及其对色素细胞影响的研究[D];山西农业大学;2016年

  本文关键词：EDN3在不同毛色绵羊皮肤中的表达及其对色素细胞影响的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：386941