shRNA转基因猪抗口蹄疫病毒的研究
发布时间：2023-12-09 16:20
口蹄疫(foot and mouth disease, F MD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性的传染病。FMDV是单链正义RNA病毒,属于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。病毒基因组的长度约为8500 nt。FMDV可以感染70多种偶蹄目动物,包括猪、牛、羊等家畜。FMD是国际兽疫局规定的A类传染病,大规模爆发会给养猪业造成巨大的经济损失。目前,注射疫苗是控制口蹄疫疫情的重要手段,但病毒具有高度的变异性,导致疫苗有效性大为降低。最近的研究已经证实在哺乳动物中RNA干扰(RNAi)可以作为一种抗病毒机制。因此,通过RNAi和转基因技术培育出表达针对口蹄疫病毒的shRNA的抗病转基因猪新品种,可能成为防控口蹄疫的有效途径,从而保障养猪业的健康发展。本研究针对口蹄疫病毒基因组保守区3D聚合酶基因和2B非结构蛋白基因设计并构建了表达shRNA抗病毒干扰载体。转基因细胞具有稳定的shRNA表达,并且和对照细胞相比,表达shRNA的转基因细胞具有高效的抗FMDV的能力。在100和1000TCID50剂量的病毒...
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词
第一章 引言
1.1 口蹄疫
1.1.1 口蹄疫与其流行现状
1.1.2 口蹄疫病毒的基因组构成
1.1.3 口蹄疫病毒的结构
1.1.4 口蹄疫病毒的感染周期
1.1.5 口蹄疫的发病机制
1.1.6 口蹄疫的防控
1.2 RNA干扰
1.2.1 RNA干扰的发现
1.2.2 RNA干扰的分子机制
1.2.3 RNA干扰与基因功能分析和基因治疗
1.2.4 RNAi与抗病毒感染
1.3 RNAi在抗FMDV中的研究
1.4 本研究的目的和意义
第二章 材料方法
2.1 实验材料
2.1.1 生物材料
2.1.2 实验仪器及耗材
2.1.3 实验试剂及溶液配制
2.2 实验方法
2.2.1 感受态细胞的制备(CaCl2法)
2.2.2 感受态细胞的转化
2.2.3 质粒DNA小量制备(OMEGA质粒提取试剂盒)
2.2.4 酶切产物的胶回收(Qiaquick胶回收试剂盒)
2.2.5 DNA片段的连接
2.2.6 去内毒素质粒的大量提取(OMEGA去内毒素大量提取试剂盒)
2.2.7 组织和细胞基因组提取(使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit)
2.2.8 PCR反应条件及体系
2.2.9 Southern Blotting
2.2.10 细胞复苏
2.2.11 细胞传代培养
2.2.12 细胞冻存
2.2.13 电转制备转基因细胞
2.2.14 转基因细胞系的筛选
2.2.15 检测病毒效价
2.2.16 检测攻毒前后转基因细胞shRNA表达水平
2.2.17 IBRS-2/BHK-21转基因细胞上检测攻毒后细胞样品病毒效价的测定
2.2.18 细胞病变效应(CPE)检测及细胞内病毒复制动力学检测
2.2.19 体细胞核移植制备转基因克隆猪
2.2.20 转基因克隆猪攻毒验证抗FMDV能力
2.2.21 血液组织中的病毒量检测
2.2.22 抗体检测
2.2.23 IFN-γ mRNA的定量分析
2.2.24 流式细胞技术分析免疫细胞
2.3 统计分析
第三章 实验结果与分析
3.1 构建口蹄疫病毒特异性shRNA表达载体
3.2 转基因细胞系的建立及筛选
3.3 shRNA转基因细胞有稳定的siRNAs表达并能显著地抗抵口蹄疫病毒感染
3.3.1 检测攻毒前后细胞shRNA表达水平变化
3.3.2 攻毒前后病毒滴度(TCID50)水平的变化
3.3.3 细胞病变效应与病毒复制动力学
3.4 制备转基因克隆猪并鉴定shRNA的表达
3.4.1 体细胞核移植制备转基因克隆猪和非转基因克隆猪
3.4.2 克隆猪的分子检测
3.5 shRNA转基因克隆猪抵抗口蹄疫病毒感染效果的攻毒验证
3.5.1 预实验确定病毒SID50
3.5.2 攻毒实验分组
3.5.3 临床症状的分析和体温变化情况
3.5.4 血毒症消长动力学
3.5.5 屠宰后组织带毒鉴定
3.5.6 攻毒后猪的抗体应答分析
3.5.7 攻毒后猪血液中的IFN-γ的变化分析
3.5.8 攻毒后猪血液中的免疫细胞的变化分析
3.5.9 攻毒后猪血液中口蹄疫病毒序列的变化分析
3.6 小结
第四章 讨论与展望
结论
参考文献
附录
致谢
个人简历
本文编号：3871803
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
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摘要
Abstract
缩略词
第一章 引言
1.1 口蹄疫
1.1.1 口蹄疫与其流行现状
1.1.2 口蹄疫病毒的基因组构成
1.1.3 口蹄疫病毒的结构
1.1.4 口蹄疫病毒的感染周期
1.1.5 口蹄疫的发病机制
1.1.6 口蹄疫的防控
1.2 RNA干扰
1.2.1 RNA干扰的发现
1.2.2 RNA干扰的分子机制
1.2.3 RNA干扰与基因功能分析和基因治疗
1.2.4 RNAi与抗病毒感染
1.3 RNAi在抗FMDV中的研究
1.4 本研究的目的和意义
第二章 材料方法
2.1 实验材料
2.1.1 生物材料
2.1.2 实验仪器及耗材
2.1.3 实验试剂及溶液配制
2.2 实验方法
2.2.1 感受态细胞的制备(CaCl2法)
2.2.2 感受态细胞的转化
2.2.3 质粒DNA小量制备(OMEGA质粒提取试剂盒)
2.2.4 酶切产物的胶回收(Qiaquick胶回收试剂盒)
2.2.5 DNA片段的连接
2.2.6 去内毒素质粒的大量提取(OMEGA去内毒素大量提取试剂盒)
2.2.7 组织和细胞基因组提取(使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit)
2.2.8 PCR反应条件及体系
2.2.9 Southern Blotting
2.2.10 细胞复苏
2.2.11 细胞传代培养
2.2.12 细胞冻存
2.2.13 电转制备转基因细胞
2.2.14 转基因细胞系的筛选
2.2.15 检测病毒效价
2.2.16 检测攻毒前后转基因细胞shRNA表达水平
2.2.17 IBRS-2/BHK-21转基因细胞上检测攻毒后细胞样品病毒效价的测定
2.2.18 细胞病变效应(CPE)检测及细胞内病毒复制动力学检测
2.2.19 体细胞核移植制备转基因克隆猪
2.2.20 转基因克隆猪攻毒验证抗FMDV能力
2.2.21 血液组织中的病毒量检测
2.2.22 抗体检测
2.2.23 IFN-γ mRNA的定量分析
2.2.24 流式细胞技术分析免疫细胞
2.3 统计分析
第三章 实验结果与分析
3.1 构建口蹄疫病毒特异性shRNA表达载体
3.2 转基因细胞系的建立及筛选
3.3 shRNA转基因细胞有稳定的siRNAs表达并能显著地抗抵口蹄疫病毒感染
3.3.1 检测攻毒前后细胞shRNA表达水平变化
3.3.2 攻毒前后病毒滴度(TCID50)水平的变化
3.3.3 细胞病变效应与病毒复制动力学
3.4 制备转基因克隆猪并鉴定shRNA的表达
3.4.1 体细胞核移植制备转基因克隆猪和非转基因克隆猪
3.4.2 克隆猪的分子检测
3.5 shRNA转基因克隆猪抵抗口蹄疫病毒感染效果的攻毒验证
3.5.1 预实验确定病毒SID50
3.5.3 临床症状的分析和体温变化情况
3.5.4 血毒症消长动力学
3.5.5 屠宰后组织带毒鉴定
3.5.6 攻毒后猪的抗体应答分析
3.5.7 攻毒后猪血液中的IFN-γ的变化分析
3.5.8 攻毒后猪血液中的免疫细胞的变化分析
3.5.9 攻毒后猪血液中口蹄疫病毒序列的变化分析
3.6 小结
第四章 讨论与展望
结论
参考文献
附录
致谢
个人简历
本文编号：3871803
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