牛肠道病毒的分离鉴定及HLJ-3531株感染性分子克隆的建立
发布时间：2024-02-01 13:06
牛肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属成员,为单股正链RNA病毒。病毒粒子无囊膜,为二十面体球形结构,粒子直径约为2530nm,基因组长度约为7500bp。2011年第9次国际病毒分类委员会分类报告将牛肠道病毒分类为EV-E和EV-F,其中EV-E分为EV-E1E4,EV-F分为EV-F1F6。牛肠道病毒的首次发现是在上世纪50年代末,由Kunin和Mc Ferran分别从健康牛粪便中分离得到,随后世界各地陆续有该病毒的分离报道,但中国关于此病毒的流行报道较少。牛肠道病毒的病原性并不明显,但由于其有时会侵犯其他器官而导致临床上各种综合征的出现。牛肠道病毒的感染宿主较广,包括牛、羊、马、犬、羊驼等动物。本研究从奶牛场采集两批粪便样本,第一批样本采自诊断为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性的患病奶牛,第二批样本采自患有消化道疾病症状的奶牛,同时从该牛场采集获得9份牛血清,血清经BVDV抗原及抗体检测均为阴性。两批病料共先后分离得到10株病毒,经BVDV巢式RT-PCR检测均为阴性。因此,本研究对分离病毒按未知病毒进行鉴定,核酸...
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
1.1 牛肠道病毒概述
1.1.1 形态结构与理化性质
1.1.2 基因结构及功能
1.1.3 病毒的分类
1.1.4 病毒的感染与复制
1.2 牛肠道病毒的流行现状
1.2.1 国外流行现状
1.2.2 国内流行现状
1.2.3 牛肠道病毒的检测技术
1.3 RNA病毒的反向遗传学研究
1.3.1 反向遗传学概述
1.3.2 RNA病毒反向遗传学发展历程
1.3.3 反向遗传学在肠道病毒中的应用
1.4 本研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验动物、病料、血清
2.1.2 细胞、病毒、培养基
2.1.3 质粒与菌株
2.1.4 酶类与主要试剂
2.1.5 主要设备和仪器
2.1.6 试剂配制
2.1.7 试验参考毒株序列信息
2.2 牛肠道病毒的分离与鉴定
2.2.1 病料的处理
2.2.2 病毒的分离
2.2.3 病毒TCID50测定
2.2.4 病毒的蚀斑纯化
2.2.5 病毒的核酸型鉴定
2.2.6 随机RT-PCR鉴定第一批病料
2.2.7 RT-PCR鉴定第二批病料
2.2.8 病毒的鉴定
2.3 乳鼠感染模型的建立
2.3.1 感染模型的建立
2.3.2 多重感染模型的建立
2.4 牛肠道病毒的全基因克隆
2.4.1 引物设计
2.4.2 病毒m RNA的提取
2.4.3 5’RACE法扩增 5’端片段
2.4.4 其它目的片段扩增
2.4.5 PCR产物的纯化与回收
2.4.6 PCR产物的连接与转化
2.4.7 重组质粒的鉴定及测序
2.4.8 全基因序列的拼接和分析
2.5 HLJ-3531株重组病毒的拯救
2.5.1 引物设计及连接策略
2.5.2 病毒RNA的提取
2.5.3 PCR反应扩增目的基因
2.5.4 克隆载体的构建
2.5.5 全长重组克隆载体p BSK-3531的构建
2.5.6 重组病毒的拯救
2.5.7 重组病毒的鉴定
2.5.8 重组病毒生物学特性的研究
3 结果与分析
3.1 牛肠道病毒的分离鉴定
3.1.1 病毒的分离
3.1.2 病毒的TCID50测定
3.1.3 病毒的蚀斑纯化
3.1.4 病毒的核酸型鉴定
3.1.5 第一批病料PCR鉴定结果
3.1.6 第二批病料PCR鉴定结果
3.1.7 病毒的鉴定
3.2 乳鼠感染模型建立
3.2.1 感染模型建立
3.2.2 多重感染模型的建立
3.3 牛肠道病毒的全基因克隆
3.3.1 5’端的克隆
3.3.2 其他片段的扩增与鉴定
3.3.3 序列拼接及基因组结构分析
3.3.4 N-糖基化位点比较分析
3.3.5 进化树分析
3.3.6 VP1氨基酸比对
3.4 HLJ-3531株感染性分子克隆的建立
3.4.1 3531-A、3531-B片段的克隆
3.4.2 重组克隆载体构建结果
3.4.3 全长重组克隆载体p BSK-3531的构建结果
3.4.4 重组病毒的拯救
3.4.5 重组病毒r HLJ-3531的鉴定
3.4.6 重组病毒r HLJ-3531的特性研究
4 讨论
4.1 牛肠道病毒的分离鉴定
4.2 两株病毒的宿主嗜性分析
4.3 动物模型的建立及组织分布
4.3.1 感染动物的选择
4.3.2 感染方式的选择
4.3.3 感染组织分布
4.3.4 两株病毒乳鼠感染模型差异的分析
4.4 病毒的全基因序列克隆方法的分析
4.4.1 全基因克隆策略的选择
4.4.2 RACE扩增法及其影响因素
4.5 两株牛肠道病毒的分类分析
4.6 HLJ-3531的感染性克隆构建
4.6.1 全长c DNA构建策略
4.6.2 重组病毒的鉴定
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文
本文编号：3892163
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
1.1 牛肠道病毒概述
1.1.1 形态结构与理化性质
1.1.2 基因结构及功能
1.1.3 病毒的分类
1.1.4 病毒的感染与复制
1.2 牛肠道病毒的流行现状
1.2.1 国外流行现状
1.2.2 国内流行现状
1.2.3 牛肠道病毒的检测技术
1.3 RNA病毒的反向遗传学研究
1.3.1 反向遗传学概述
1.3.2 RNA病毒反向遗传学发展历程
1.3.3 反向遗传学在肠道病毒中的应用
1.4 本研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验动物、病料、血清
2.1.2 细胞、病毒、培养基
2.1.3 质粒与菌株
2.1.4 酶类与主要试剂
2.1.5 主要设备和仪器
2.1.6 试剂配制
2.1.7 试验参考毒株序列信息
2.2 牛肠道病毒的分离与鉴定
2.2.1 病料的处理
2.2.2 病毒的分离
2.2.3 病毒TCID50测定
2.2.4 病毒的蚀斑纯化
2.2.5 病毒的核酸型鉴定
2.2.6 随机RT-PCR鉴定第一批病料
2.2.7 RT-PCR鉴定第二批病料
2.2.8 病毒的鉴定
2.3 乳鼠感染模型的建立
2.3.1 感染模型的建立
2.3.2 多重感染模型的建立
2.4 牛肠道病毒的全基因克隆
2.4.1 引物设计
2.4.2 病毒m RNA的提取
2.4.3 5’RACE法扩增 5’端片段
2.4.4 其它目的片段扩增
2.4.5 PCR产物的纯化与回收
2.4.6 PCR产物的连接与转化
2.4.7 重组质粒的鉴定及测序
2.4.8 全基因序列的拼接和分析
2.5 HLJ-3531株重组病毒的拯救
2.5.1 引物设计及连接策略
2.5.2 病毒RNA的提取
2.5.3 PCR反应扩增目的基因
2.5.4 克隆载体的构建
2.5.5 全长重组克隆载体p BSK-3531的构建
2.5.6 重组病毒的拯救
2.5.7 重组病毒的鉴定
2.5.8 重组病毒生物学特性的研究
3 结果与分析
3.1 牛肠道病毒的分离鉴定
3.1.1 病毒的分离
3.1.2 病毒的TCID50测定
3.1.3 病毒的蚀斑纯化
3.1.4 病毒的核酸型鉴定
3.1.5 第一批病料PCR鉴定结果
3.1.6 第二批病料PCR鉴定结果
3.1.7 病毒的鉴定
3.2 乳鼠感染模型建立
3.2.1 感染模型建立
3.2.2 多重感染模型的建立
3.3 牛肠道病毒的全基因克隆
3.3.1 5’端的克隆
3.3.2 其他片段的扩增与鉴定
3.3.3 序列拼接及基因组结构分析
3.3.4 N-糖基化位点比较分析
3.3.5 进化树分析
3.3.6 VP1氨基酸比对
3.4 HLJ-3531株感染性分子克隆的建立
3.4.1 3531-A、3531-B片段的克隆
3.4.2 重组克隆载体构建结果
3.4.3 全长重组克隆载体p BSK-3531的构建结果
3.4.4 重组病毒的拯救
3.4.5 重组病毒r HLJ-3531的鉴定
3.4.6 重组病毒r HLJ-3531的特性研究
4 讨论
4.1 牛肠道病毒的分离鉴定
4.2 两株病毒的宿主嗜性分析
4.3 动物模型的建立及组织分布
4.3.1 感染动物的选择
4.3.2 感染方式的选择
4.3.3 感染组织分布
4.3.4 两株病毒乳鼠感染模型差异的分析
4.4 病毒的全基因序列克隆方法的分析
4.4.1 全基因克隆策略的选择
4.4.2 RACE扩增法及其影响因素
4.5 两株牛肠道病毒的分类分析
4.6 HLJ-3531的感染性克隆构建
4.6.1 全长c DNA构建策略
4.6.2 重组病毒的鉴定
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文
本文编号：3892163
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3892163.html
