递呈胸膜肺炎放线杆菌GalT蛋白的大肠杆菌外膜囊泡免疫效果评价

发布时间：2024-02-21 22:44

　　胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌,每年给全球养猪业造成巨大的经济损失。本研究旨在利用大肠杆菌外膜囊泡(OMVs)递呈APP GalT蛋白,并对其免疫效果进行研究,初步探索其作为新型候选疫苗的潜力。首先,成功构建了能表达APP GalT蛋白的重组大肠杆菌。以大肠杆菌JC8031作为表达菌,pBAD18-Cm作为表达载体,先后将clyA(909bp)和galT(1050bp)基因片段连入载体中,经终浓度为0.2%L-阿拉伯糖诱导5h后,重组大肠杆菌能够表达由ClyA和GalT组成的融合蛋白,大小约为75KD。其次,成功建立了递呈APP GalT蛋白的大肠杆菌OMVs制备方法。诱导20h后的重组大肠杆菌首先经低速离心分离上清,随后使用分子截留量为100KD的超滤管对上清液进行浓缩,再经120,000×g超速离心3h分离沉淀后得到大肠杆菌外膜囊泡悬液。分离到的大肠杆菌外膜囊泡直径在20-150nm之间;Western-blotting鉴定显示重组外膜囊泡中APP GalT蛋白。最后,证明了递呈APP Gal...

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1-2pBAD18-ClyA-GalT重组质粒酶切鉴定：M.DNA分子质量标准；1.HindⅢ单酶切；

GE及质谱检测融合蛋白组质粒pBAD18-ClyA-GalT的表达菌JC8031进行L-阿心收集菌体破壁处理后进行SDS-PAGE电泳检测，结空质粒组，重组菌明显存在一根过表达条带（图1-3）。行质谱鉴定，经搜库比对后发现可同时比对出大肠杆菌-ClyA-GalT....

图1-3重组质粒表达SDS-PAGE电泳：M.蛋白分子量标准；1.未诱导的空白质粒表达；

nblotting检测融合蛋白表达过L-阿拉伯糖诱导表达后的重组表达菌，用PB上样缓冲液处理后，进行SDS-PAGE电泳。以，HRP标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，用增强型化色液，结果显示经诱导后的重组表达菌中有一条表达SDS-PAGE电泳：M.蛋白分子量标准....

图1-5外膜囊泡透射电镜拍照

组外膜囊泡的分离与鉴定射电镜拍照离得到的外膜囊泡悬液进行透射电镜拍照，结果显示成功分离约为20-150nm之间，与文献报道一致，说明异源蛋白的引入的形态发生改变（图1-5）。组质粒表达免疫印迹检测：M.蛋白分子量标准；1.未诱导的表达菌菌estern-blotting....

图1-6外膜囊泡免疫印迹检测：M.蛋白分子量标准；1.空白囊泡；2.重组囊泡；3.阳

estern-blotting验证囊泡加入适量的蛋白上样缓冲液处理克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗小L）试剂作为底物显色液，以重组表达示重组表达菌所分泌的外膜囊泡中可以呈到外膜囊泡中（图1-6）。

本文编号：3906000