乳腺上皮细胞细菌诱导型启动子的构建和活性检测

发布时间：2017-05-24 17:28

  本文关键词：乳腺上皮细胞细菌诱导型启动子的构建和活性检测，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乳腺炎是由于细菌或者真菌等病原微生物感染乳腺组织而引发的一系列炎症反应。乳腺炎不仅影响了山羊的健康,也对产奶量以及奶质量造成影响,对畜牧业造成很大的经济损失。白介素-1作为一种细胞因子,在调控炎症反应中起重要作用,其启动子在细菌刺激条件下可以诱导外源基因的表达。高效特异性表达的启动子是转基因抗乳腺炎研究领域的关键因素。Bce1(β-casein element 1)为一条长为160bp的牛酪蛋白增强子,它含有催乳素依赖性的调控作用的应答元件并参与催乳素介导的调控。BCE1通过对催乳素介导的调控增加启动子的上皮细胞机制的依赖性,从而可能会影响启动子的组织特异性表达功能。本实验将Bce1置于白介素IL-1α启动子的上游,从而组成一个更加有效的乳腺上皮细胞细菌诱导型启动子。本文较系统地研究了Bce1增强子对IL-1α启动子的组织特异性调控作用,比较了其在人胚肾细胞(Human embryonic kidney 293T cell,HEK-293T)、奶山羊肺上皮细胞(Lung epithelial cell,GLEC)以及奶山羊乳腺上皮细胞(Mammary epithelial cell,GMEC)中的表达,初步证明了该启动子的活性以及组织特异性。结果如下:(1)分别使用LPS(Lipopolysaccharide,脂多糖)对原代山羊乳腺上皮细胞处理0、2、4、6、8、10 h,通过RT-qPCR定量试验检测不同处理时长IL-1α基因mRNA的表达量,并发现在6 h时表达量有明显的升高(P0.05)。初步验证了IL-1α基因在山羊乳腺上皮细胞中的细菌诱导活性。(2)利用高保真PCR方法从奶山羊基因组克隆奶山羊IL-1α启动子(1587bp),从牛基因组上克隆牛酪蛋白Bce1增强子序列(160bp)。经酶切鉴定,成功构建了具有表达功能的pGL4.10-IL1α和pGL4.10-IL1α-Bce1的真核表达载体。同时使用双荧光素酶报告基因测试系统证明从奶山羊基因组上扩增得到的IL-1α启动子片段具有活性,且具有细菌诱导性。(3)构建出山羊乳腺组织特异性的细菌诱导型真核表达载体,并通过双荧光素酶报告系统进行验证。验证结果表明,Bce1对IL-1α启动子的组织特异性调控在LPS诱导后得到体现,具体表现为,在GMEC组中,真核表达载体pGL4.10-ILα1-Bce1在LPS攻菌组的表达量明显高于PBS处理组(P0.05);LPS处理后,真核表达载体pGL4.10-ILα1-Bce1在GMEC中表达量相对于pGL4.10-ILα1有显著提升,而在GLEC和293T上表达量并没有升高(P0.05),这表明成功构建了组织特异性细菌诱导型启动子。本研究成功克隆了IL-1α启动子序列和牛酪蛋白增强子Bce1序列;并以pGL4.10为骨架,构建双荧光报告载体pGL4.10-IL1α和pG4.10-IL1α-Bce1,证明启动子IL-1α的细菌诱导性以及Bce1介导的IL-1α启动子所产生的组织特异性表达。本研究为提高临床奶山羊乳腺炎防治技术奠定了理论和实验基础。
【关键词】：牛酪蛋白增强子 白介素-1 乳腺组织特异性 细菌诱导型 山羊乳腺上皮细胞
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.27
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1.1 乳腺炎研究进展12-13
• 1.1.1 乳腺炎的发展史12
• 1.1.2 乳腺炎的分类12-13
• 1.1.3 乳腺炎的危害13
• 1.2 乳腺炎的预防与治疗13-15
• 1.2.1 卫生管理13
• 1.2.2 疫苗接种13
• 1.2.3 产前挤奶13-14
• 1.2.4 蚊虫控制14
• 1.2.5 交叉哺乳14
• 1.2.6 防止或减少乳腺水肿的影响14-15
• 1.2.7 综合管理措施15
• 1.3 抗乳腺炎基因的研究进展15-19
• 1.3.1 可溶性因子16-18
• 1.3.2 细菌诱导型启动子18
• 1.3.3 组织特异型启动子18-19
• 1.4 牛β酪蛋白基因19-22
• 1.4.1 牛β酪蛋白基因简介19
• 1.4.2 牛β酪蛋白增强子19-22
• 1.5 小结22-24
• 第二章 脂多糖刺激山羊乳腺上皮细胞中的IL-1αmRNA表达水平检测24-29
• 2.1 材料和试剂24
• 2.1.1 材料24
• 2.1.2 试剂24
• 2.2 实验方法24-27
• 2.2.1 山羊乳腺上皮细胞的原代培养24-25
• 2.2.2 LPS处理细胞25
• 2.2.3 cDNA的制备和实时定量PCR反应（real-time PCR）25-27
• 2.3 结果27-28
• 2.4 讨论28
• 2.5 小结28-29
• 第三章 细菌诱导型荧光素酶报告载体构建及功能验证29-39
• 3.1 材料和试剂29
• 3.1.1 材料29
• 3.1.2 试剂29
• 3.2 实验方法29-35
• 3.2.1 载体构建29-34
• 3.2.2 真核表达载体转染HEK293T细胞34
• 3.2.3 双荧光素酶报告基因测试34-35
• 3.3 结果35-38
• 3.3.1 IL1-α启动子和Bce1增强子的扩增和真核表达载体构建35-37
• 3.3.2 真核表达载体的功能验证37-38
• 3.4 讨论38
• 3.5 小结38-39
• 第四章 嵌合启动子组织特异性细菌诱导活性的检测39-45
• 4.1 材料和试剂39
• 4.1.1 材料39
• 4.1.2 试剂39
• 4.2 实验方法39-40
• 4.2.1 山羊乳腺上皮细胞和山羊肺上皮细胞细胞的原代培养39-40
• 4.2.2 不同载体分别转染GMEC和GLEC40
• 4.2.3 双荧光素酶报告基因测试40
• 4.3 结果40-43
• 4.3.1 真核表达载体在GMEC的表达40-41
• 4.3.2 真核表达载体在GLEC的表达41-42
• 4.3.3 真核表达载体在HEK293T细胞的表达42-43
• 4.4 讨论43-44
• 4.5 小结44-45
• 全文结论45-46
• 展望以及进一步研究46-47
• 参考文献47-56
• 附录56-60
• 缩略词60-61
• 致谢61-62
• 作者简介62

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