ETEC 987P基因工程乳酸菌的制备及其免疫效果的检测

发布时间：2024-03-11 05:51

　　产肠毒属性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是人和多种动物感染腹泻的重要病原菌之一，引起新生仔猪腹泻和死亡的几率非常高。黏附素和肠毒素是ETEC致病过程中的主要致病因子，他们在致病过程中缺一不可。其中黏附素结合到宿主易感染的上皮细胞是ETEC感染的第一步，也是最重要的关键步骤。目前引起仔猪腹泻的菌毛抗原主要有K88、K99、987P、F41等类型。本试验选择987P菌毛抗原，并将扩增出的987P基因片段克隆到大肠杆菌与干酪乳杆菌穿梭质粒载体中，从而构建了pLA-987P重组质粒，在将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中，得到了重组干酪乳杆菌pLA-987P/L.casei，通过SDS-PAGE、Western blot、间接免疫荧光及流式细胞术等来检测重组蛋白的表达情况，结果表明，融合蛋白成功的展示在了干酪乳杆菌表面，我们将获得的重组干酪乳杆菌命名为pLA-987P/L.casei。 将鉴定正确的重组干酪乳杆菌pLA-987P/L.casei口服接种SPF级BABL/c小鼠，同时将获得的重组菌同pLA-K99-K88-LTB/L.casei混...

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 产肠毒素性大肠杆菌的概述及其疫苗的研究进展
        1.1.1 产肠毒素大肠杆菌菌毛黏附素的研究进展
        1.1.2 肠毒素
        1.1.3 ETEC 疫苗的研究进展
    1.2 乳酸菌作为抗原呈递载体的研究进展
        1.2.1 乳酸菌简介
        1.2.2 乳酸菌益生功能的研究现状
        1.2.3 乳酸菌作为外源抗原呈递载体的优越性
        1.2.4 乳酸菌对机体免疫作用的影响
        1.2.5 乳酸菌作为口服疫苗呈递载体的应用
    1.3 研究的目的与意义
第二章 重组 ETEC 987P 干酪乳杆菌的构建
    2.1 材料
        2.1.1 质粒和菌株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 方法
        2.2.1 重组表达载体 pLA-987P 的构建
        2.2.2 ETEC 987P 重组干酪乳杆菌表达载体的构建
        2.2.3 ETEC 987P 重组干酪乳杆菌的鉴定
        2.2.4 外源蛋白在乳酸菌表面的定位
    2.3 结果
        2.3.1 ETEC 987P 菌毛基因 PCR 扩增
        2.3.2 重组质粒的酶切鉴定结果
        2.3.3 PCR 扩增干酪乳杆菌转化子的结果
        2.3.4 Western blot 蛋白表达检测结果
        2.3.5 间接免疫荧光法鉴定重组蛋白在乳酸菌表面的表达
        2.3.6 流式细胞术鉴定外源蛋白在干酪乳杆菌表面的表达
    2.4 讨论
    2.5 结论
第三章 重组 ETEC 987P 干酪乳杆菌免疫小鼠研究
    3.1 材料
        3.1.1 试验动物
        3.1.2 菌株
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 主要仪器
    3.2 方法
        3.2.1 免疫用重组干酪乳杆菌悬液的制备
        3.2.2 试验动物的分组及免疫
        3.2.3 样本采集
        3.2.4 间接 ELISA
        3.2.5 淋巴细胞的免疫学试验
        3.2.6 细胞因子的检测
        3.2.7 小鼠攻毒保护性试验
    3.3 结果
        3.3.1 重组蛋白的纯化结果
        3.3.2 血清中 ETEC 987P 特异性 IgG 效价
        3.3.3 粪便中抗 987P 特异性 sIgA 效价的测定
        3.3.4 小肠冲洗液和气管冲洗液中特异性 sIgA 效价的测定
        3.3.5 血清中 IgG 抗体亚类的检测结果
        3.3.6 淋巴细胞增殖实验
        3.3.7 细胞因子的检测结果
        3.3.8 小鼠的攻毒保护结果
    3.4 讨论
    3.5 结论
参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3925921