猪副流感病毒5型全基因组序列分析及反向遗传操作系统建立

发布时间：2024-03-21 18:29

　　猪副流感病毒(porcine parainfluenza-5 virus,PPIV5)系不分节段的单股负链RNA病毒,为副粘病毒科,腮腺炎病毒属成员之一。在1956年该病毒首次在猴体内被发现和被分离,并被命名为猴病毒5型(SV5),在1995年国际病毒学分类委员会上该病毒被正式命名为(simian parainfluenzavirus 5)。后该病毒在其他动物体内及细胞培养物中均被检测到,意味着猴并不是该病毒的唯一宿主,于是在2009年病毒学分类委员会上该病毒被首次命名为(parainfluenza virus 5,PIV5)。2018年国际病毒学委员会上将该病毒重新命名为(mammalian rubulavirus 5),本文中将使用PIV5表示副流感病毒。在本实验室前期工作当中,将该病毒做仔猪动物回归实验(详细数据另行发表,未在本文中体现),结果表明该病毒虽然可感染猪肠道但不会导致腹泻及体温升高,尽本人所知无文献报道该病毒会导致猪只严重疾病。故本研究目的为建立PPIV5的反向遗传操作系统,为作为递送外源蛋白的载体奠定基础。将分离到的PPIV5病毒命名为CHNJS-17株,根据Gen...

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第一章 文献综述
    1.1 PPIV5 分类
    1.2 PPIV5 结构
    1.3 PPIV5 蛋白功能
    1.4 PPIV5 基因组结构
    1.5 副粘病毒感染细胞的方式
    1.6 副粘病毒反向遗传操作系统研究进展
    1.7 负链RNA病毒作为载体疫苗进展
第二章 PPIV5 全基因组测序及序列分析
    2.1 材料
        2.1.1 细胞与毒株来源
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 参考毒株
    2.2 方法
        2.2.1 PPIV5 全基因组分段扩增引物设计与合成
        2.2.2 5'/3'RACE套式引物的设计与合成
        2.2.3 病毒繁殖、鉴定及RNA的提取
        2.2.4 病毒c DNA的合成
        2.2.5 病毒全基因组分段RT-PCR的建立
        2.2.6 病毒全基因组分段胶回收
        2.2.7 感受态细胞的制备
        2.2.8 病毒全基因组的连接及转化
        2.2.9 摇菌、重组质粒的鉴定、提取及测序
        2.2.10 病毒RNA的 Poly(A)修饰及纯化
        2.2.11 病毒5'、3'RACE反应的建立
        2.2.12 PPIV5-F、HN基因的扩增
    2.3 结果
        2.3.1 病毒在Vero上的增殖结果
        2.3.2 PPIV5的PCR鉴定结果
        2.3.3 PPIV5 的电镜检测结果
        2.3.4 病毒基因组分段扩增结果
        2.3.5 5'、3'RACE反应建立的结果
        2.3.6 PPIV5 病毒的测序及拼接结果
        2.3.7 PPIV5-F、HN基因扩增结果
        2.3.8 PPIV5 病毒全基因核苷酸序列进化树分析结果
        2.3.9 PPIV5 全基因苷酸序列同源性分析结果
        2.3.10 PPIV5 F基因进化树分析结果
        2.3.11 PPIV5 HN进化树基因分析结果
        2.3.12 PPIV5 F基因同源性分析结果
        2.3.13 PPIV5 HN基因同源性分析结果
    2.4 讨论
第三章 PPIV5 反向遗传全长的质粒构建及辅助质粒的构建
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、细胞、感受态细胞及载体
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要实验仪器
    3.2 方法
        3.2.1 PPIV5 CHNJS-17 株全基因组感染性克隆的构建
        3.2.2 全基因组载体选择
        3.2.3 元件序列合成
        3.2.4 引物设计
        3.2.5 反应体系
        3.2.6 PPIV5-C片段的克隆
        3.2.7 CHNJS-17 株辅助质粒N/P/L的构建引物设计
    3.3 结果
        3.3.1 A和 D段扩增结果
        3.3.2 元件扩增结果
        3.3.3 ABCD段扩增结果
        3.3.4 PPIV5-ABD拼接结果
        3.3.5 全基因组拼接结果
        3.3.6 辅助质粒构建结果
    3.4 讨论
第四章 PPIV5 及表达EGFP的重组PPIV5 的拯救及鉴定
    4.1 材料
        4.1.1 细胞及质粒
        4.1.2 主要试剂
    4.2 材料
        4.2.1 病毒拯救
        4.2.2 电镜检测
        4.2.3 间接免疫荧光及一步生长曲线检测
        4.2.4 表达EGFP的重组PPIV5 的构建策略
    4.3 结果
        4.3.1 拯救的病毒粒子P1 代电镜
        4.3.2 拯救的病毒粒子P10 代电镜
        4.3.3 拯救的病毒粒子P10 代间接免疫荧光结果
        4.3.4 拯救的病毒粒子分子标签的检测
        4.3.5 拯救的病毒第10 代一步生长曲线测定
        4.3.6 表达EGFP的重组PPIV5 的鉴定
    4.4 讨论
第五章 结论
参考文献
致谢
个人简历
附录



本文编号：3933972