miR-4331对TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤的调控作用及机制研究

发布时间：2017-05-25 19:06

  本文关键词：miR-4331对TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤的调控作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：microRNA(miRNA)是一类不编码蛋白质的小RNA分子,成熟的miRNA由19~23个核苷酸组成。miRNA通过与靶mRNA 3'非翻译区(untranslated region,UTR)结合,抑制mRNA翻译或降解mRNA,调控靶基因的表达水平,从而发挥广泛的生物学作用,如参与调控发育、细胞凋亡和线粒体损伤等。猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染猪肾细胞(PK-15)可通过线粒体信号通路诱导细胞凋亡,同时,TGEV感染PK-15细胞后,miRNA表达谱发生了变化,且miR-4331表达量显著上调。本论文拟以miR-4331为研究对象,探讨其对TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤的调控作用及机制。首先检测mi R-4331对TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤的作用;其次验证miR-4331的靶基因,检测miR-4331靶基因对线粒体损伤的作用;最后检测mi R-4331及其靶基因对调控线粒体损伤相关信号通路的作用,阐明miR-4331调控线粒体损伤的机制。得到如下结果。1.将miR-4331 mimics或inhibitors转染至PK-15细胞,再感染TGEV,分别检测线粒体钙离子浓度和膜电位,结果显示,过表达miR-4331后线粒体钙离子浓度显著增加、膜电位显著降低,抑制miR-4331则线粒体钙离子浓度显著降低、膜电位显著升高,结果表明,miR-4331促进TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤。iTRAQ试验检测过表达mi R-4331且感染TGEV的PK-15细胞,细胞蛋白表达谱发生变化,共得到69个差异表达的蛋白,其中33个蛋白表达量上调,36个蛋白表达量下调。2.利用双荧光素酶试验和western blotting验证miR-4331靶基因。首先将候选靶基因野生型3′UTR以及其突变型3′UTR分别克隆至双荧光素酶质粒psiCHECK-2,构建含靶基因野生型3′UTR、突变型3′UTR的双荧光素酶重组质粒;然后将miR-4331 mimics或inhibitors与双荧光素酶重组质粒共转染至PK-15细胞,检测miR-4331与靶基因野生型、突变型3′UTR的结合活性,结果显示,转染miR-4331 mimics和RB1野生型3′UTR重组质粒的细胞,其双荧光素酶活性显著降低;而转染miR-4331 inhibitors和RB1野生型3′UTR重组质粒的细胞,其双荧光素酶活性显著升高。western blotting检测miR-4331对RB1蛋白表达量的影响,发现过表达miR-4331抑制RB1的表达。进一步试验证明,在TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤过程中,RB1可以下调线粒体钙离子浓度、上调线粒体膜电位,起到减轻线粒体损伤的作用。3.通过对iTRAQ检测出的差异表达蛋白进行GO注释和KEGG分析,并利用siRNA(small interfering RNA)沉默RB1基因表达,结果导致IL1-R和p38的表达量均显著上调;沉默IL1-R表达后,p38的表达量发生下调;分别沉默IL1-R和p38的表达,则线粒体钙离子浓度均表现为下调和线粒体膜电位均表现为上调。以上结果表明,p38 MAPK信号转导通路调控线粒体损伤是miR-4331调控TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤的主要信号通路之一。本研究发现miR-4331促进TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤,iTRAQ分析发现mi R-4331过表达导致TGEV感染的PK-15细胞蛋白表达谱发生变化。双荧光素酶试验和western blotting结果证明RB1是miR-4331的靶基因。还发现mi R-4331和RB1通过调控p38 MAPK信号通路而调控TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤。研究结果阐明了mi R-4331在TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤过程中的作用与调控机制,为进一步研究宿主细胞mi RNA与TGEV的相互作用提供理论依据。
【关键词】：猪传染性胃肠炎病毒 miRNA PK-15细胞 线粒体损伤
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.3
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 前言12-13
• 文献综述13-17
• 第一章 miRNA参与调控线粒体损伤研究进展13-17
• 1.1 miRNA的产生及作用机制13-14
• 1.2 线粒体损伤的特征14
• 1.3 病毒与线粒体损伤14-15
• 1.4 miRNA调控病毒诱导线粒体损伤15-16
• 1.5 本研究的目的与意义16-17
• 试验内容17-52
• 第二章 miR-4331对TGEV诱导PK-15细胞线粒体损伤的作用17-34
• 2.1 材料17
• 2.1.1 主要试剂17
• 2.1.2 主要仪器17
• 2.1.3 细胞及毒株17
• 2.2 方法17-23
• 2.2.1 细胞的培养17
• 2.2.2 TGEV细胞半数感染量（TCID50）的测定17-18
• 2.2.3 miR-4331对线粒体损伤的调控作用18-22
• 2.2.4 iTRAQ检测试验样品准备22
• 2.2.5 iTRAQ数据分析22
• 2.2.6 差异表达蛋白的验证22-23
• 2.3 结果23-33
• 2.3.1 miR-4331对TGEV诱导线粒体损伤的作用23-26
• 2.3.2 miR-4331过表达后蛋白质组学分析26-29
• 2.3.3 iTRAQ检测结果的生物信息学分析29-32
• 2.3.4 差异表达蛋白的验证32-33
• 2.4 讨论33
• 2.5 小结33-34
• 第三章 miR-4331潜在靶基因的验证及靶基因对线粒体损伤的调控作用34-45
• 3.1 材料34
• 3.1.1 主要试剂34
• 3.1.2 主要仪器34
• 3.2 方法34-40
• 3.2.1 miR-4331靶基因双荧光素酶载体的构建34-38
• 3.2.2 双荧光素酶试验验证miR-4331的靶基因38
• 3.2.3 western blotting验证miR-4331靶基因38
• 3.2.4 RB1对TGEV诱导线粒体损伤作用的检测38-40
• 3.3 结果40-43
• 3.3.1 双荧光素酶载体的鉴定40
• 3.3.2 RB1为miR-4331的靶基因40-42
• 3.3.3 RB1对TGEV诱导线粒体损伤的作用42-43
• 3.4 讨论43
• 3.5 小结43-45
• 第四章 miR-4331通过p38 MAPK信号通路对线粒体损伤的调控作用45-52
• 4.1 材料45
• 4.1.1 主要试剂45
• 4.1.2 主要仪器45
• 4.2 方法45-47
• 4.2.1 p38 MAPK信号通路对线粒体损伤调控作用的检测45-46
• 4.2.2 miR-4331对p38 MAPK信号通路调控作用的检测46-47
• 4.2.3 RB1对p38 MAPK信号通路调控作用的检测47
• 4.3 结果47-50
• 4.3.1 IL1-R和p38对TGEV诱导线粒体损伤的作用47-48
• 4.3.2 IL1-R调控p38的表达48-49
• 4.3.3 miR-4331调控p38 MAPK信号通路49
• 4.4.4 RB1调控p38 MAPK信号通路49-50
• 4.4 讨论50-51
• 4.5 小结51-52
• 结论与创新点52-53
• 参考文献53-57
• 缩略词57-58
• 致谢58-59
• 作者简介59

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