禽网状内皮组织增殖症病毒三种检测方法的建立

发布时间：2024-04-09 04:41

　　禽网状内皮组织增生病(ReticuLoendotheliosis, RE)是由禽网内状皮组织增生病病毒(ReticuLoendotheliosis Virus, REV)引起禽类发生的以淋巴网状细胞增生为特征的肿瘤性病理综合征。REV在我国家禽中的感染率已达30%左右,REV感染不仅能引起肿瘤,还可以引起胸腺、法氏囊等免疫器官萎缩,导致免疫功能下降、甚至免疫抑制,并且极易继发感染其他病毒病和细菌病。REV一旦污染生物制品后,可以导致REV大面积人工传播,给养禽业造成严重的经济损失。因为REV感染鸡群无明显症状和病变,因此REV的检测显得尤为重要。 本文首先以禽网状内皮组织增殖症病毒的cDNA建立了PCR检测方法。是以全病毒感染为基础所建立的检测方法。在REV的3个基因上设计了3种特异引物,能特异性的检测REV样品,最低检测限度为104拷贝/uL。PCR检测方法不与其他禽病病原发生交叉反应,重复性和稳定性好。 其次以REV的LTR和gag基因的保守区域各设计并合成一对引物,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法(Real-time PCR)。以pMD-18T-LTR (p-L...

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1.引言
    1.1 禽网状内皮组织增殖症及禽网状内皮增殖症病毒
        1.1.1 禽网状内皮组织增生病概述
        1.1.2 REV生物学特征
        1.1.3 传播途径
        1.1.4 发病机理
        1.1.5 临床症状
        1.1.6 危害
        1.1.7 防治措施
    1.2 禽网状内皮组织增殖病的实验室诊断技术研究进展
        1.2.1 病毒的分离鉴定
        1.2.2 抗体的检测
        1.2.3 抗原的检测
        1.2.4 分子诊断技术
        1.2.5 鉴别诊断
    1.3 实验室诊断技术的意义
2.REV聚合酶链式反应(PCR)检测方法的建立
    2.1 材料
        2.1.1 聚合酶及其他试剂
        2.1.2 实验材料
        2.1.3 仪器
    2.2 方法
        2.2.1 PCR的引物设计
        2.2.2 REV增殖，RNA的提取及反转录
        2.2.3 PCR扩增
        2.2.4 PCR产物的纯化
        2.2.5 PCR扩增产物的测序鉴定
        2.2.6 最佳反应模式的确定
        2.2.7 PCR检测方法敏感性的检测
        2.2.8 PCR检测方法特异性的检测
        2.2.9 重复性和稳定性试验
    2.3 结果
        2.3.1 REV PCR扩增结果
        2.3.2 PCR反应条件的优化
        2.3.3 PCR检测方法敏感性的检测
        2.3.4 PCR检测方法特异性的检测
        2.3.5 重复性和稳定性试验结果
    2.4 讨论
3.REV SYBR Green Ⅰ实时荧光检测方法的建立
    3.1 材料
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 主要试剂及仪器
    3.2 方法
        3.2.1 引物的设计与合成
        3.2.2 REV增殖, RNA的提取及反转录
        3.2.3 标准品的制备
        3.2.4 荧光定量最佳反应模式的确定
        3.2.5 标准曲线、熔解曲线的绘制
        3.2.6 特异性试验
        3.2.7 敏感性试验
        3.2.8 重复性试验
        3.2.9 样品检测
    3.3 结果
        3.3.1 标准曲线的建立
        3.3.2 特异性试验
        3.3.3 敏感性试验将
        3.3.4 重复性试验
        3.3.5 样品检测
    3.4 讨论
4.REV间接ELISA检测方法的建立
    4.1 材料
        4.1.1 实验试剂
        4.1.2 实验材料
        4.1.3 主要仪器
    4.2 方法
        4.2.1 禽网状内皮组织増殖病病毒pET32a-gp90原核表达载体构建
        4.2.2 pET32a-gp90蛋白的原核表达和鉴定
        4.2.3 pET32a-gp90基因片段表达产物的Westenr Blot分析
        4.2.4 pET32a-gp90基因片段原核表达蛋白的纯化
        4.2.5 pET32a-gp90间接ELISA检测方法的建立
        4.2.6 特异性试验
        4.2.7 间接ELISA重复性试验
        4.2.8 抗体间接ELISA与同类商品化试剂盒的对比
    4.3 实验结果
        4.3.1 pET32a-gp90基因片段重组表达载体的鉴定
        4.3.2 pET32a-gp90基因片段在大肠杆菌中的表达
        4.3.3 表达蛋白的Western-blotting分析
        4.3.4 pET32a-gp90基因片段原核表达蛋白的可溶性分析
        4.3.5 pET32a-gp90基因片段表达产物的纯化分析
        4.3.6 pET32a-gp90蛋白间接ELISA方法的建立
        4.3.7 pET32a-gp90蛋白间接ELISA特异性检测
        4.3.8 pET32a-gp90蛋白间接ELISA重复性试验
        4.3.9 pET32a-gp90蛋白间接ELISA与同类商品化试剂盒的对比
    4.4 讨论
5.三种检测方法的比较
6.结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文



本文编号：3949333