伪狂犬病毒IE180基因3'UTR的G-四链体可形成序列结构与功能分析

发布时间：2024-04-13 17:12

　　猪伪狂犬病给我国养猪业造成了巨大的经济损失,当前的疫苗不能完全防止由变异毒株带来的危害。揭示病毒感染、传播、潜伏、再激活等机制,有利于研发新的疫苗,开发新的抗病毒药物。目前的很多研究主要是基于蛋白展开的,在核酸水平揭示机制,有望给伪狂犬病毒研究提供新的思路。G-四链体是由鸟嘌呤富集序列形成的特殊核酸二级结构,许多病毒基因组中的G-四链体可以调控相关基因的转录以及翻译过程。猪伪狂犬病毒中的G-四链体可形成序列也有可能影响伪狂犬病毒的复制。IE180基因作为伪狂犬病毒基因组中唯一的立即早期基因,激活其它基因转录和复制。本研究发现IE180基因3’UTR区域存在大量G-四链体可形成序列,研究这些序列对转录、翻译的影响,有望揭示G-四链体在伪狂犬病毒中的功能,开发靶向G-四链体的抗病毒抑制剂。本论文具体工作如下:1.IE180基因3’UTR的G-四链体可形成序列的结构与功能分析1)在IE180基因3’UTR搜索到两段有望形成G-四链体的富G序列(157-170区间与256-366区间);2)发现157-170序列符合G-四链体可形成序列特征,但形成双螺旋结构,其结构的形成抑制报告基因的翻译;3...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略表语
第一章 绪论
    1 伪狂犬病毒
        1.1 伪狂犬病
        1.2 伪狂犬病毒
        1.3 IE180基因
    2 G-四链体
        2.1 G-四链体结构
        2.2 G-四链体的生物学意义
    3 G-四链体及配体在病毒中的研究
        3.1 HIV基因组中G-四链体和TmPyP4
        3.2 EBV中EBNA1基因mRNAG-四链体和PDS
        3.3 HSV-1基因组中G-四链体和BRACO-19
    4 G-四链体在3’端非翻译区中的功能
        4.1 调控mRNA稳定性
        4.2 调控mRNA的亚细胞定位
        4.3 调控翻译过程
    5 论文设计思想
第二章 IE180基因3’UTR的G-四链体可形成序列的结构与功能分析
    1 前言
    2 试剂与仪器
        2.1 化学药品与生物试剂
        2.2 仪器
    3 材料与方法
        3.1 3 ’RACE法克隆PRVEa毒株IE180基因3’UTR
            3.1.1 从感染病毒的细胞样品中提取总RNA
            3.1.2 3 ’末端快速扩增技术
            3.1.3 目的片段克隆
        3.2 不同伪狂犬病毒毒株IE180基因3’UTR序列收集与保守性分析
        3.3 G-四链体可形成序列预测软件分析IE180基因3’UTR富G序列
        3.4 圆二色光谱分析核酸形成的结构
        3.5 构建含有野生型与突变型3’UTR双荧光素酶报告载体
            3.5.1 克隆野生型3’UTR双荧光素酶报告质粒
            3.5.2 同源重组法构建突变型3’UTR双荧光素酶报告质粒
        3.6 实时荧光定量PCR检测G-四链体形成对转录的影响
            3.6.1 质粒转染
            3.6.2 提取细胞总RNA
            3.6.3 模板cDNA制备
            3.6.4 实时荧光定量PCR
        3.7 双荧光素酶报告系统检测G-四链体形成对翻译的影响
            3.7.1 质粒转染
            3.7.2 双荧光素酶检测
        3.8 数据统计分析
    4 结果与分析
        4.1 PRVEa毒株IE180基因3’UTR序列克隆
        4.2 IE180基因3’UTRG-四链体可形成序列鉴定及结构分析
            4.2.1 IE180基因3’UTR富G序列分析
            4.2.2 富G序列157-170分析
                4.2.2.1 富G序列157-170保守性分析
                4.2.2.2 富G序列157-170结构分析
            4.2.3 富G序列256-366分析
                4.2.3.1 富G序列256-366保守性分析
                4.2.3.2 富G序列256-366结构分析
                4.2.3.3 G-四链体可形成序列PQS3与PQS18保守性分析
                4.2.3.4 G-四链体可形成序列PQS3与PQS18结构分析
        4.3 IE180基因3’UTR的G-四链体可形成序列对转录和翻译的影响
            4.3.1 野生型与突变型3’UTR双荧光素酶报告载体构建
            4.3.2 富G序列157-170对转录和翻译的影响
                4.3.2.1 富G序列157-170对转录的影响
                4.3.2.2 富G序列157-170对翻译的影响
            4.3.3 富G序列256-366对转录和翻译的影响
                4.3.3.1 富G序列256-366对转录的影响
                4.3.3.2 富G序列256-366对翻译的影响
                4.3.3.3 G-四链体可形成序列PQS3对转录和翻译的影响
                4.3.3.4 G-四链体可形成序列PQS18对转录和翻译的影响
    5 结论
第三章 G-四链体配体小分子TmPyP4抗伪狂犬病毒研究
    1 前言
    2 试剂与仪器
        2.1 化学药品与生物试剂
        2.2 仪器
    3 材料与方法
        3.1 紫外-可见吸收光谱分析TmPyP4与PQS18相互作用
        3.2 G-四链体配体小分子TmPyP4对293T细胞毒性分析实验
        3.3 双荧光素酶报告系统检测TmPyP4对转录和翻译的影响
        3.4 G-四链体配体小分子TmPyP4对PK15细胞毒性分析实验
        3.5 TmPyP4抗病毒实验
            3.5.1 TmPyP4与病毒的直接相互作用
            3.5.2 TmPyP4作用于病毒增殖过程
    4 结果与分析
        4.1 TmPyP4稳定PQS18G-四链体结构
        4.2 TmPyP4对报告基因转录与翻译的影响
            4.2.1 TmPyP4对293T细胞最大适用浓度
            4.2.2 TmPyP4对报告基因转录和翻译影响
        4.3 TmPyP4抗伪狂犬病毒分析
            4.3.1 TmPyP4对PK15细胞最大适用浓度的检测
            4.3.2 TmPyP4对PRV的灭活作用
            4.3.3 TmPyP4对PRV增殖过程的影响
    5 结论
第四章 总结与展望
    1 结论
    2 展望
参考文献
附录
    S1 引物表
    S2 载体
    S3 不同伪狂犬病毒毒株IE180基因3’UTR序列比对结果
    S4 突变型3’UTR双荧光素酶报告载体
致谢



本文编号：3953364