扩展莫尼茨绦虫vasa基因的原核表达及多克隆抗体的制备

发布时间：2024-04-13 17:34

　　试验旨在表达、纯化扩展莫尼茨绦虫VASA蛋白,并制备兔抗VASA多克隆抗体。根据扩展莫尼茨绦虫全基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增vasa基因片段;将扩增产物与原核表达载体pET-22b(+)连接,获得重组质粒pET-22b-VASA;经Amp抗性筛选阳性菌,双酶切、PCR测序鉴定后,将其转化大肠杆菌(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达;重组融合蛋白经镍柱纯化后,进行Western blot鉴定;将融合蛋白免疫兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒pET-22b-VASA构建正确,通过IPTG诱导获得大小约32 200的VASA重组融合蛋白;Western blot分析表明其与鼠抗His单克隆抗体呈阳性反应。纯化的VASA蛋白免疫兔获得了多克隆抗体,ELISA检测其效价为1∶128 000。本试验成功制备了具有免疫原性的VASA蛋白及其兔源多克隆抗体,为VASA蛋白生物学功能及该蛋白在绦虫体内的分布等研究奠定基础。

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【部分图文】：

图1vasa基因片段PCR扩增结果

重组质粒,用XhoI、MluⅠ进行双酶切获得1628,4537bp2个片段,结果表明获得了含vasa基因的重组质粒(图2),其中PET-22b为空质粒对照(图3)。图2PET-22b-vasa重组质粒的双酶切鉴定

图2PET-22b-vasa重组质粒的双酶切鉴定

图1vasa基因片段PCR扩增结果图3PET-22b空质粒电泳图

图3PET-22b空质粒电泳图

图2PET-22b-vasa重组质粒的双酶切鉴定2.3重组蛋白的表达鉴定

图4pET-22b-vasaSDS-PAGE电泳结果

SDS-PAGE分析结果表明,pET-22b-vasa诱导前没有相应的特异条带;37℃,0.5mmol/LIPTG条件下诱导4h后在约32200处出现与预计大小一致的条带;表明目的基因在大肠杆菌中获得正确表达(图4),且在37℃,IPTG终浓度为0.2mmol/L的沉....

本文编号：3953389