靶向NF-κB1基因RNAi对DEV增殖的影响
发布时间：2024-04-21 13:19
鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)是威胁和危害水禽养殖产业健康发展的重要病原之一,但其致病机理尚未得到完全阐明。NF-κB分子是动物机体NF-κB信号通路关键分子,在动物多种生物学过程中发挥重要作用,与炎症过程和病毒侵染有关,且NF-κB信号通路的关键调控因子有IL-1β等细胞因子,但有关DEV感染与NF-κB信号通路的关联性,未见研究报道。为此,本研究采用RNAi技术沉默NF-κB1基因,分析NF-κB1基因对DEV增殖影响,以及分析NF-κB信号通路的下游关键调控因子IL-1β的变化,以期为DEV致病机理的揭示提供一些基础依据。1.鸭源IL-1β基因RT-PCR检测方法的建立根据GenBank上鸭源IL-1β基因设计特异性引物,进行PCR扩增得到IL-1β基因片段,回收纯化后连接至pMD19-T载体,转化至大肠杆菌并增菌,提取重组质粒进行鉴定,以重组质粒为模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测并进行特异性、重复性和敏感性检验,结果显示:建立的鸭源IL-1β基因荧光定量PCR方法扩增曲线良好,标准曲线方程y=-3.329x+39.731,扩增效率...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
略缩词
文献综述
1 DEV概况
1.1 DEV形态结构特征
1.2 DEV增殖过程
1.3 DEV致病特征及防控
2 NF-κB信号通路概况
2.1 NF-κB家族成员
2.2 NF-κB信号通路的激活
2.3 NF-κB信号通路与病原体感染
3 RNAi技术概况
3.1 RNAi技术简介
3.2 RNAi作用机制
3.3 RNAi技术应用
实验研究
前言
1 材料
1.1 实验动物
1.2 毒株和质粒
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
2 方法
2.1 IL-1β实时荧光定量PCR方法的建立
2.1.1 IL-1β引物合成
2.1.2 IL-1β PCR扩增
2.1.3 标准质粒构建
2.1.4 荧光定量PCR方法建立
2.2 DEV感染后鸭各组织IL-1β的变化
2.2.1 人工感染及样品采集
2.2.2 DEV-NP基因PCR检测
2.2.3 IL-1β基因的转录水平变化
2.3 NF-κB1 sh RNA质粒的筛选
2.3.1 鸭胚成纤维细胞的制备与培养
2.3.2 干扰重组质粒转染DEF细胞
2.3.3 NF-κB1基因转录情况检测
2.3.4 干扰重组质粒对DEF细胞自身的影响
2.4 NF-κB1 RNAi对DEF细胞中DEV增殖的影响
2.4.1 DEV和干扰重组质粒处理DEF细胞
2.4.2 DEV-NP基因的检测
2.4.3 NF-κB关键因子IL-1β的检测
2.4.4 NF-κB通路下游因子的检测
3 结果
3.1 IL-1β实时荧光定量PCR方法的建立
3.1.1 IL-1β基因标准质粒的构建
3.1.2 荧光定量PCR方法建立结果
3.1.3 重复性、敏感性、特异性检验
3.2 DEV感染后鸭各组织IL-1β转录变化
3.2.1 DEV-NP基因PCR检测结果
3.2.2 IL-1β基因转录水平变化
3.3 干扰重组质粒筛选
3.3.1 干扰重组质粒干扰效率比较
3.3.2 干扰重组质粒对DEF细胞的影响
3.4 NF-κB1 RNAi对DEV在DEF细胞中增殖的影响
3.4.1 干扰重组质粒转染荧光观察
3.4.2 DEV-NP基因的检测
3.4.3 NF-κB关键因子IL-1β的检测
3.4.4 NF-κB通路下游因子的检测
4 分析与讨论
4.1 关于DEV感染后鸭组织中IL-1β的检测
4.2 NF-κB与IL-1β的关系
4.3 NF-κB与DEV的关系
4.4 NF-κB与机体正常细胞生长的关系
5 展望
全文结论
参考文献
致谢
附录
本文编号：3960927
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
略缩词
文献综述
1 DEV概况
1.1 DEV形态结构特征
1.2 DEV增殖过程
1.3 DEV致病特征及防控
2 NF-κB信号通路概况
2.1 NF-κB家族成员
2.2 NF-κB信号通路的激活
2.3 NF-κB信号通路与病原体感染
3 RNAi技术概况
3.1 RNAi技术简介
3.2 RNAi作用机制
3.3 RNAi技术应用
实验研究
前言
1 材料
1.1 实验动物
1.2 毒株和质粒
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
2 方法
2.1 IL-1β实时荧光定量PCR方法的建立
2.1.1 IL-1β引物合成
2.1.2 IL-1β PCR扩增
2.1.3 标准质粒构建
2.1.4 荧光定量PCR方法建立
2.2 DEV感染后鸭各组织IL-1β的变化
2.2.1 人工感染及样品采集
2.2.2 DEV-NP基因PCR检测
2.2.3 IL-1β基因的转录水平变化
2.3 NF-κB1 sh RNA质粒的筛选
2.3.1 鸭胚成纤维细胞的制备与培养
2.3.2 干扰重组质粒转染DEF细胞
2.3.3 NF-κB1基因转录情况检测
2.3.4 干扰重组质粒对DEF细胞自身的影响
2.4 NF-κB1 RNAi对DEF细胞中DEV增殖的影响
2.4.1 DEV和干扰重组质粒处理DEF细胞
2.4.2 DEV-NP基因的检测
2.4.3 NF-κB关键因子IL-1β的检测
2.4.4 NF-κB通路下游因子的检测
3 结果
3.1 IL-1β实时荧光定量PCR方法的建立
3.1.1 IL-1β基因标准质粒的构建
3.1.2 荧光定量PCR方法建立结果
3.1.3 重复性、敏感性、特异性检验
3.2 DEV感染后鸭各组织IL-1β转录变化
3.2.1 DEV-NP基因PCR检测结果
3.2.2 IL-1β基因转录水平变化
3.3 干扰重组质粒筛选
3.3.1 干扰重组质粒干扰效率比较
3.3.2 干扰重组质粒对DEF细胞的影响
3.4 NF-κB1 RNAi对DEV在DEF细胞中增殖的影响
3.4.1 干扰重组质粒转染荧光观察
3.4.2 DEV-NP基因的检测
3.4.3 NF-κB关键因子IL-1β的检测
3.4.4 NF-κB通路下游因子的检测
4 分析与讨论
4.1 关于DEV感染后鸭组织中IL-1β的检测
4.2 NF-κB与IL-1β的关系
4.3 NF-κB与DEV的关系
4.4 NF-κB与机体正常细胞生长的关系
5 展望
全文结论
参考文献
致谢
附录
本文编号：3960927
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