河北保定地区奶牛源微小隐孢子虫分离鉴定及CP23蛋白免疫原性分析

发布时间：2024-04-21 14:42

　　隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是隐孢子虫(Cryptosporidium)寄生于人类和动物呼吸道或消化道上皮细胞刷状缘纳虫空泡中,以腹泻、脱水为主要临床症状的寄生性原虫病。隐孢子虫可感染多种动物,其中幼龄动物最易感,是新生动物腹泻的病因之一。隐孢子虫病已严重危害人类和动物健康,给畜牧业带来严重的经济损失,目前无有效的治疗药物,疫苗免疫是防控该病的新策略,因此,筛选免疫原性高的靶抗原具有相当重要的意义。目前保定地区对微小隐孢子虫相关研究较少,对重组蛋白CP23免疫特性进行研究,为抗微小隐孢子虫疫苗和免疫学诊断方法的研制提供了候选抗原,为隐孢子虫病的防控奠定了基础。本试验从河北保定地区分离得到奶牛源隐孢子虫卵囊,通过PCR扩增获得18SrRNA全基因1188bp的片段,构建pEASY-18SrRNA质粒并测序,对测序序列应用DNAStar软件进行分析,结果表明分离到的虫种为微小隐孢子虫。将Cp23基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET28a-Cp23。并用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE结果显示,表达蛋白分子量为25kDa,且为包涵体蛋...

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
1 引言
    1.1 隐孢子虫概述
        1.1.1 病原学研究
        1.1.2 生活史
        1.1.3 流行特点
        1.1.4 表面粘附蛋白
        1.1.5 实验室诊断技术
        1.1.6 疫苗研究进展
    1.2 研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 虫株与载体
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 主要试剂与试剂盒
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 主要溶液的配制
        2.1.6 数据分析
    2.2 隐孢子虫分离与鉴定
        2.2.1 隐孢子虫卵囊的分离与镜检
        2.2.2 隐孢子虫PCR鉴定
        2.2.3 pEASY-18SrRNA质粒构建及序列测序
    2.3 18 SrRNA荧光定量PCR方法的建立
        2.3.1 荧光定量PCR引物验证
        2.3.2 反应条件的优化
        2.3.3 标准曲线的建立
        2.3.4 特异性分析
        2.3.5 重复性分析
        2.3.6 荧光定量PCR方法临床应用
    2.4 原核表达载体的构建与蛋白表达
        2.4.1 pEASY-CP23克隆质粒的构建及鉴定
        2.4.2 pET28-CP23表达质粒构建及鉴定
        2.4.3 重组菌诱导表达及鉴定
    2.5 CP23蛋白免疫原性分析
        2.5.1 动物分组及血清制备
        2.5.2 体液免疫水平检测
        2.5.3 细胞免疫水平检测
3.结果
    3.1 隐孢子虫分离鉴定结果
        3.1.1 卵囊分离与镜检结果
        3.1.2 18 SrRNA基因PCR扩增结果
        3.1.3 pEASY-18SrRNA测序结果
    3.2 荧光定量PCR方法的建立
        3.2.1 荧光定量PCR引物验证
        3.2.2 荧光定量PCR条件的优化
        3.2.3 扩增曲线的绘制
        3.2.4 特异性分析
        3.2.5 重复性分析结果
        3.2.6 临床样品检测结果
    3.3 pET28a-CP23载体构建与蛋白表达结果
        3.3.1 pEASY-CP23质粒的鉴定结果
        3.3.2 pET28-CP23质粒鉴定结果
        3.3.3 重组菌诱导表达及鉴定结果
    3.4 CP23蛋白免疫原性分析
        3.4.1 IgG抗体水平变化分析
        3.4.2 CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞数量的变化
        3.4.3 脾淋巴细胞增殖试验结果
        3.4.4 细胞因子检测结果
4.讨论
5.结论
参考文献
作者简介
在读期间发表的学术论文
致谢
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本文编号：3961023