副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

发布时间：2024-05-12 07:17

　　副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)和猪支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是引起猪发生呼吸道综合征(PRDC)的重要致病因子。机体在各种应激因素的影响下或感染导致免疫力下降的病毒性疾病时,均易导致Hps和Bb的感染率大大增加。这两种病原菌混合感染情况十分普遍,且都易引起猪呼吸道隐性感染及急、慢性炎症,临床症状相似不易区分,给临床诊断和防治带来困难。本研究依据Hps OMP P2基因和Bb DNT基因成功建立了一种快速、简便、精准和灵敏的可同时检测具有毒力的副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌的诊断方法。通过试验证实,建立的双重PCR法特异性强,敏感性高,重复性好,并成功应用于临床实践。1.双重PCR方法的建立依据Hps OMP P2和Bb DNT基因序列各设计1对引物,并对引物进行二聚体、同源性、互补性分析,试验预计分别能扩增出748 bp和344 bp的DNA片段。利用设计的引物分别对Hps OMP P2基因和Bb DNT基因进行PCR扩增,并在单一PCR基础上进一步优化双重PCR的反应条件,包括引物浓度、退火温度...

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
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第一章 文献综述
    1 副猪嗜血杆菌
        1.1 副猪嗜血杆菌病概述
        1.2 副猪嗜血杆菌的特性
            1.2.1 病原特性
            1.2.2 培养特性
        1.3 副猪嗜血杆菌主要毒力因子
            1.3.1 外膜蛋白(OMP)
            1.3.2 荚膜多糖(CP)
            1.3.3 脂多糖(LPS)
            1.3.4 转铁蛋白
            1.3.5 菌毛
            1.3.6 酶类
        1.4 副猪嗜血杆菌病的发病机理
        1.5 副猪嗜血杆菌病的流行病学
        1.6 临床症状及病理变化
        1.7 副猪嗜血杆菌诊断方法
            1.7.1 细菌分离
            1.7.2 血清学诊断方法
            1.7.3 PCR方法
        1.8 副猪嗜血杆菌病的治疗与防制
            1.8.1 药物防治
            1.8.2 疫苗
    2 支气管败血波氏杆菌病
        2.1 支气管败血波氏杆菌病概述
        2.2 支气管败血波氏杆菌的特性
            2.2.1 病原特性
            2.2.2 培养特性
        2.3 支气管败血波氏杆菌主要毒力因子
            2.3.1 丝状血凝素(FHA)
            2.3.2 百日咳杆菌粘附素(PRN)
            2.3.3 菌毛(fimbriae)
            2.3.4 腺苷环化酶溶血素(AC-Hly)
            2.3.5 皮肤坏死毒素(DNT)
            2.3.6 Ⅲ型分泌系统(type-Ⅲ secretion system)
        2.4 支气管败血波氏杆菌病的发病机理
        2.5 支气管败血波氏杆菌病的流行特征
        2.6 临床症状及病理变化
        2.7 支气管败血波氏杆菌诊断方法
            2.7.1 传统诊断方法
            2.7.2 分子生物学诊断
        2.8 支气管败血波氏杆菌病的治疗与防制
            2.8.1 药物防治
            2.8.2 疫苗预防
            2.8.3 饲养管理
    3 本研究的目的意义及主要内容
第二章 副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法的建立
    1 材料与方法
        1.1 菌株及病料
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 引物的设计与合成
        1.5 模板的制备
    2 单一检测Hps和Bb的PCR方法的建立
        2.1 单一PCR扩增及Hps各血清型检测
        2.2 PCR产物检测
        2.3 单一PCR各参数的优化
        2.4 单一PCR的特异性检验
        2.5 单一PCR的敏感性检验
    3 双重PCR检测方法的建立
        3.1 双重PCR条件的优化
        3.2 双重PCR方法敏感性试验
        3.3 双重PCR方法的特异性试验
        3.4 双重PCR方法的重复性试验
        3.5 双重PCR阳性产物测序及序列分析
        3.6 双重PCR方法与其他检测方法的比较
    4 结果
        4.1 单一PCR方法的建立
            4.1.1 单一PCR扩增及Hps各血清型检测
            4.1.2 单一PCR阳性产物的克隆测序与序列分析
            4.1.3 单一PCR扩增各参数的优化结果
            4.1.4 单一PCR特异性试验结果
            4.1.5 单一PCR敏感性试验结果
        4.2 双重PCR扩增条件的优化结果
            4.2.1 双重PCR引物浓度的优化
            4.2.2 双重PCR退火温度优化结果
            4.2.3 双重PCR延伸时间优化结果
            4.2.4 双重PCR dNTPs浓度的优化
            4.2.5 双重PCR rTaq DNA polymerase浓度的优化
            4.2.6 双重PCR MgCL2浓度的优化
            4.2.7 双重PCR方法的确定
            4.2.8 双重PCR特异性试验
            4.2.9 双重PCR敏感性试验
            4.2.10 双重PCR重复性试验
            4.2.11 双重PCR阳性产物测序及序列分析
            4.2.12 双重PCR方法与其他检测方法效果比较
    5 分析讨论
    6 结论
第三章 副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法的应用
    1 实验材料
        1.1 病料
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
    2 实验方法
        2.1 病料处理及模板的制备
        2.2 Hps和Bb双重PCR检测
        2.3 双重PCR方法运用于菌落与组织样品的检测
    3 结果
        3.1 临床样品中不同组织的感染情况
        3.2 临床病料中Hps和Bb的感染情况
            3.2.1 不同地区感染情况调查
            3.2.2 不同季节感染情况调查
            3.2.3 混合感染情况调查
            3.2.4 不同日龄感染情况调查
        3.3 双重PCR方法运用于菌落与组织样品的检测
    4 讨论
        4.1 易感部位
        4.2 地区分布
        4.3 季节分布
        4.4 混合感染
        4.5 不同日龄感染情况
    5 结论
参考文献
致谢
攻读硕士期间发表的论文



本文编号：3971041