抗鸭IgY Fc片段单克隆抗体的制备
发布时间：2024-05-19 21:49
IgY是鸭体内中主要的免疫球蛋白分子之一,其在鸭体内有两种形态的分子,即完整型IgY分子和缺失型IgY分子。本课题研究目的在于制备抗鸭IgY Fc片段CH3-CH4单克隆抗体,这样就能够检测出鸭血清中完整型IgY分子。此外抗鸭IgY Fc片段CH2的单克隆抗体可以既可以检测到缺失型IgY分子也可以检测完整型IgY分子。 1：鸭IgY Fc片段CH2-CH3-CH4基因的克隆与序列分析 以BSA免疫樱桃谷肉鸭的脾脏提取总RNA,经RT-PCR扩增含有CH1部分序列的IgY Fc片段CH1-CH2-CH3-CH4,大小为1154bp,将目的基因与T载体连接,pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4重组质粒测序分析结果表明在CH2-CH3-CH4基因中存在4个碱基的突变,核苷酸同源性为99%,其突变均为无义突变,氨基酸同源性为100%。以此为模板扩增CH2-CH3-CH4基因,大小为954bp. 2：鸭IgY Fc片段CH2, CH3-CH4及CH1-CH2-CH3-CH4基因的原核表达 以pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4为模板成功扩增CH2, CH3-CH4, CH1-...
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语
1 文献综述
1.1 鸭IgY分子的研究进展
1.1.1 编码IgY的基因
1.1.2 IgY分子与哺乳动物IgG分子结构的区别
1.1.3 IgY分子在各类动物中的分布
1.1.4 IgY分子的功能
1.1.5 IgY分子的应用
1.2 单克隆抗体的研究进展
1.2.1 单克隆抗体的概念和基本原理
1.2.2 单克隆抗体筛选的基本原理
1.2.3 制备单克隆抗体的方法
1.2.4 单克隆抗体的应用
2 研究目的及意义
3 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 载体及菌株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 实验动物
3.1.4 试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 鸭IgY Fc片段CH2-CH3-CH4的克隆
3.2.2 鸭IgY Fc片段(CH2,CH3-CH4)基因亚克隆
3.2.3 重组原核表达质粒的诱导表达
3.2.4 SDS-PAGE电泳
3.2.5 表达产物可溶性检测
3.2.6 融合蛋白的纯化
3.2.7 融合蛋白的Western blot鉴定
3.2.8 小鼠免疫以及血清效价的检测
3.2.9 SP2/0骨髓瘤的准备
3.2.10 饲养细胞的制备
3.2.11 免疫脾细胞的制备
3.2.12 细胞融合
3.2.13 杂交瘤细胞的选择性培养与克隆
3.2.14 小鼠腹水法生产单克隆抗体
3.2.15 腹水单抗的纯化
3.2.16 单克隆抗体的鉴定
4 实验结果
4.1 IgY Fc片段CH2-CH3-CH4基因的克隆及其蛋白的表达
4.1.1 IgYFc片段CH1-CH2-CH3-CH4基因的RT-PCR扩增
4.1.2 IgYFc片段CH2-CH3-CH4基因序列分析
4.1.3 IgYFc片段CH2-CH3-CH4基因的亚克隆
4.1.4 pGEX-KG-CH2-CH3-CH4重组质粒的构建
4.1.5 GST-CH2-CH3-CH4蛋白的SDS-PAGE以及Western blot鉴定
4.2 IgYFc片段基因(CH2,CH3-CH4)的亚克隆及其蛋白的表达
4.2.1 IgYFc片段CH2基因以及CH3-CH4基因的扩增结果
4.2.2 pET-28a-CH2以及pET-28a-CH3-CH4重组质粒的构建
4.2.3 His-CH2和His-CH3-CH4蛋白的SDS-PAGE以及Western blot
4.3 鼠抗GST-CH2-CH3-CH4蛋白单克隆抗体的制备
4.3.1 免疫小鼠血清效价的测定
4.3.2 杂交瘤细胞株的筛选
4.3.3 单克隆抗体的纯化以及鉴定
5 讨论
5.1 融合蛋白的纯化
5.2 细胞融合
5.3 抗IgYFc片段CH2单克隆抗体筛选失败的原因分析
5.4 杂交瘤细胞的筛选与克隆
5.5 4F8单克隆抗体的交叉反应试验
6 结论
参考文献
致谢
本文编号：3978505
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语
1 文献综述
1.1 鸭IgY分子的研究进展
1.1.1 编码IgY的基因
1.1.2 IgY分子与哺乳动物IgG分子结构的区别
1.1.3 IgY分子在各类动物中的分布
1.1.4 IgY分子的功能
1.1.5 IgY分子的应用
1.2 单克隆抗体的研究进展
1.2.1 单克隆抗体的概念和基本原理
1.2.2 单克隆抗体筛选的基本原理
1.2.3 制备单克隆抗体的方法
1.2.4 单克隆抗体的应用
2 研究目的及意义
3 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 载体及菌株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 实验动物
3.1.4 试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 鸭IgY Fc片段CH2-CH3-CH4的克隆
3.2.2 鸭IgY Fc片段(CH2,CH3-CH4)基因亚克隆
3.2.3 重组原核表达质粒的诱导表达
3.2.4 SDS-PAGE电泳
3.2.5 表达产物可溶性检测
3.2.6 融合蛋白的纯化
3.2.7 融合蛋白的Western blot鉴定
3.2.8 小鼠免疫以及血清效价的检测
3.2.9 SP2/0骨髓瘤的准备
3.2.10 饲养细胞的制备
3.2.11 免疫脾细胞的制备
3.2.12 细胞融合
3.2.13 杂交瘤细胞的选择性培养与克隆
3.2.14 小鼠腹水法生产单克隆抗体
3.2.15 腹水单抗的纯化
3.2.16 单克隆抗体的鉴定
4 实验结果
4.1 IgY Fc片段CH2-CH3-CH4基因的克隆及其蛋白的表达
4.1.1 IgYFc片段CH1-CH2-CH3-CH4基因的RT-PCR扩增
4.1.2 IgYFc片段CH2-CH3-CH4基因序列分析
4.1.3 IgYFc片段CH2-CH3-CH4基因的亚克隆
4.1.4 pGEX-KG-CH2-CH3-CH4重组质粒的构建
4.1.5 GST-CH2-CH3-CH4蛋白的SDS-PAGE以及Western blot鉴定
4.2 IgYFc片段基因(CH2,CH3-CH4)的亚克隆及其蛋白的表达
4.2.1 IgYFc片段CH2基因以及CH3-CH4基因的扩增结果
4.2.2 pET-28a-CH2以及pET-28a-CH3-CH4重组质粒的构建
4.2.3 His-CH2和His-CH3-CH4蛋白的SDS-PAGE以及Western blot
4.3 鼠抗GST-CH2-CH3-CH4蛋白单克隆抗体的制备
4.3.1 免疫小鼠血清效价的测定
4.3.2 杂交瘤细胞株的筛选
4.3.3 单克隆抗体的纯化以及鉴定
5 讨论
5.1 融合蛋白的纯化
5.2 细胞融合
5.3 抗IgYFc片段CH2单克隆抗体筛选失败的原因分析
5.4 杂交瘤细胞的筛选与克隆
5.5 4F8单克隆抗体的交叉反应试验
6 结论
参考文献
致谢
本文编号：3978505
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