猪脐静脉内皮细胞中miR-140靶标基因的鉴定及在猪瘟病毒复制中的作用

发布时间：2024-05-29 00:40

　　猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),为单股正链RNA病毒,基因组长度约为12.3 kb,编码12种病毒蛋白。微小RNA(miRNAs)是存在于多种生物细胞内的非编码单链RNA,长度大约为22个核苷酸(Nucleotide,nt),主要具有RNA剪切以及基因转录前调控等功能。MiRNAs主要通过靶标目的基因的3’非编码区(3’untranslated regions,3’UTR)起作用,当miRNAs的种子序列与靶标基因序列完全互补时降解靶基因,而当不完全互补时通过抑制靶基因翻译的方式发挥作用。我们对CSFV感染的猪脐静脉内皮细胞(Swine umbilical vein endothelial cells,SUVEC)通过基因组高通量测序,进行差异miRNAs筛选。发现在CSFV感染后SUVEC中有8个显著上调和4个下调显著的miRNAs,但这些miRNAs在CSFV感染中的作用尚缺少研究。通过软件预测发现,在CSFV和SUVEC中均存在miR-140调控的靶标基因,对SUVEC中受miR-140调控靶标基因的鉴定、miR-140靶标蛋白与CS...

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
文献综述
    第一章 猪瘟病毒及miRNAs的研究进展
        1.1 猪瘟病毒的研究进展
            1.1.1 猪瘟病毒的复制增殖
            1.1.2 猪瘟病毒基因组及编码蛋白的作用
            1.1.3 猪瘟病毒基因分型和主要毒力因子
            1.1.4 猪瘟病毒的致病机理
            1.1.5 猪瘟的诊断及防控
        1.2 miRNA的研究进展
            1.2.1 miRNA的发现
            1.2.2 miRNA的加工
            1.2.3 miRNA的进化
            1.2.4 miRNA对细胞功能的影响
            1.2.5 宿主miRNA与病毒感染
            1.2.6 病毒miRNAs(v-miRNAs)
            1.2.7 猪瘟病毒感染细胞的miRNAs
        1.3 本研究的目的和意义
试验研究
    第二章 miR-140对CSFV复制的影响
        2.1 材料
            2.1.1 病毒、细胞、血清和主要试剂
            2.1.2 主要仪器设备
        2.2 方法
            2.2.1 miR-140 模拟物、抑制剂的设计与合成及定量引物
            2.2.2 绝对荧光定量标准曲线的建立
            2.2.3 猪瘟病毒复制曲线的建立
            2.2.4 猪瘟病毒感染细胞后miR-140 的检测
            2.2.5 miR-140 mimics对 CSFV复制的影响
            2.2.6 miR-140 inhibitors对 CSFV复制的影响
        2.3 结果
            2.3.1 绝对定量标准曲线的建立
            2.3.2 猪瘟病毒复制曲线的建立
            2.3.3 猪瘟病毒感染细胞miR-140 检测
            2.3.4 miR-140 mimics对猪瘟病毒复制的影响
            2.3.5 miR-140 inhibitors对猪瘟病毒复制的影响
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 猪脐静脉内皮细胞中miR-140 预测靶标基因Rab25 的鉴定
        3.1 材料
            3.1.1 细胞、病毒、血清及主要试剂
            3.1.2 主要仪器设备
        3.2 方法
            3.2.1 miR-140 靶向猪脐静脉内皮细胞靶基因的预测
            3.2.2 双荧光素酶报告系统检测miR-140与Rab25 基因的靶标关系
            3.2.3 miR-140对Rab25 影响的RT-qPCR检测
            3.2.4 miR-140对Rab25 影响的Western blot检测
        3.3 结果
            3.3.1 预测miR-140 靶向猪脐静脉内皮细胞中的靶标基因
            3.3.2 双荧光素酶报告系统检测miR-140与Rab25 基因的结合
            3.3.3 miR-140对Rab25 核酸表达的影响
            3.3.4 miR-140对Rab25 蛋白表达的影响
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 Rab25对CSFV复制影响及与NS2、NS3、NS5A蛋白共定位研究
        4.1 材料
            4.1.1 细胞、病毒、血清及主要试剂
            4.1.2 主要仪器设备
        4.2 方法
            4.2.1 引物设计与合成
            4.2.2 Rab25 干扰、表达载体及NS5A分段表达载体的构建
            4.2.3 Rab25对CSFV复制的影响
            4.2.4 猪瘟病毒感染对miR-140及Rab25 的影响
            4.2.5 Rab25与NS2、NS3、NS5A的细胞定位观察
            4.2.6 Rab25与NS5A基因片段表达产物的细胞共定位观察
        4.3 结果
            4.3.1 重组质粒的构建与鉴定
            4.3.2 Rab25 对猪瘟病毒复制的影响
            4.3.3 CSFV感染细胞对miR-140和Rab25 的影响
            4.3.4 Rab25与NS5A蛋白细胞定位观察
            4.3.5 Rab25与NS5A基因片段表达产物的细胞定位观察
        4.4 讨论
        4.5 小结
结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3983836