运用电穿孔介导的CRISPR/Cas9系统敲除水牛受精卵MSTN基因的研究

发布时间：2024-05-29 22:48

　　水牛是重要的肉役两用家畜,人们对水牛性状的改良一直都在研究。CRISPR/Cas9技术的发展让快速、高效地改良水牛性状成为可能。研究表明MSTN(肌肉生长抑制素)基因对骨骼肌生长有调控作用。本研究在CRISPR/Cas9系统基础上设计了一种电穿孔工具和多条规则性gRNA,结合电穿孔技术将Cas9蛋白和多条规则性gRNA导入水牛受精卵对MSTN基因进行敲除。研究结果具体如下:1.水牛受精卵电穿孔参数的确定通过电穿孔技术将EGFP mRNA导入水牛受精卵,根据受精卵荧光阳性率和随后胚胎的发育情况探讨最佳电穿孔参数。当脉冲时间(2ms)、脉冲次数(3次)、脉冲时间间隔(0.2s)一定时,脉冲电压为30V组胚胎的囊胚发育率均显著高于40V和50V组,胚胎荧光阳性率低于40V组但高于50V组(P<0.05)。当脉冲电压(30v)、脉冲次数(4次)、脉冲时间间隔(0.2s)一定时,脉冲时间为4ms组的胚胎荧光阳性率显著高于2ms组(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05);当电脉冲时间为6ms时对受精卵损伤较大。当脉冲电压(30v)、脉冲时间(4ms)、脉冲时间间隔(0...

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－１?ＺＦＮ的基本结构??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｔｈｅ?ｓｔｕｒｅｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ｚｉｎｃ?Ｆｉｎｇｅｒ??

Ｍｏｄｉｆｉｅｄ?ｆｒｏｍ?Ｐｏｒｔｏｕｓ?ａｎｄ?Ｃａｒｒｏｌｌ?（２００５）?Ｎａｔ??Ｂｉｏｔｅｃｈ?２３：９６７－９７３??图１－２?ＺＦＮ的定点切割ＤＮＡ??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｔｕｒｅｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ｚｉｎｃ?Ｆｉｎｇｅｒ?ｓｈｅａｒｓ?ＤＮＡ??１．３....

图１－３?ＴＡＬＥＮ的的结构??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｔｈｅ?ｓｔｕｒｅｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＴＡＬＥＮ??

重复可变双残基，ＲＶＤ，棍状显示）来识别一个单一的碱基对。ＴＡＬＥＮ目标位点由两??个ＴＡＬＥ结合位点组成，这两个位点间通过不同长度的间隔区序列（１２－２０ｂｐ）分开。??ＴＡＬＥ可以被设计成仅仅识别左半侧位点或右半侧位点（图１－３）。??１?＾?＾８??＿??錄?１２赖??我ｔ....

图１－４?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的的结构??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４?Ｔｈｅ?ｓｔｕｒｅｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９??

结合后引导Ｃａｓ９蛋白对目的ＤＮＡ片段５＇－２０ｎｔ－ＮＧＧ或５＇－ＣＣＮ－２０ｎｔ位置进行随??机切割［３７，?３８］。ＰＡＭ的ＮＧＧ位点在生物体基因组中大量分布，因此在不同目的打靶基??因中设计ｇＲＮＡ还是比较容易。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９具体结构如图１－４。??＾?．??⑥茂....

图１－６体细胞核移植与电穿孔ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９效率比较??Ｆｉｇｕｒｅ?１－６?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＳＣＮＴ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ＧＥＥＰ?ｍｅｔｈｏｄ??

出了一个较好的解决方案。２０１６年Ｆｕｍｉｎｏｒｉ?Ｔａｎｉｈａｒａ等继续优化这种方法运用在猪胚??胎上进行基因编辑，发现整个过程可以在１０钟完成，相比于传统的体细胞核移植育种??技术大大缩短了工作时间和工作流程［７３］，显示出非常高的基因敲除工作效率（图１－６）。??？?１３?....

本文编号：3984222