抗H3N2亚型犬流感病毒重组犬源化抗体的制备及特性分析

发布时间：2024-06-27 23:27

　　由于异源抗体在宠物临床治疗中易引起宿主免疫排斥反应,因此制备基于本动物源的基因工程抗体显示了更大的发展优势和前景。为制备H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)的重组犬源化抗体scFv-Fc,采集CIV感染犬外周血淋巴细胞提取总RNA,利用PCR技术扩增IgG重链(VH)、轻链(VL)和Fc片段。利用重叠延伸PCR将VH和VL通过弹性肽链linker连接成单链抗体(scFv)片段,并转化大肠杆菌,挑取阳性菌测序。经分析筛选后,将目标scFv与Fc片段链接,构建scFv-Fc重组犬源抗体片段。经诱导表达,获得分子量约为50 kD的scFv和约为89 kD的重组抗体scFv-Fc。抗体活性测定结果表明,scFv能与CIV特异性结合,1 mg/mL scFv的ELISA效价为1∶2¹⁰,血凝抑制(HI)效价为1∶2⁷,中和抗体效价为1∶20。1 mg/mL scFv-Fc的HI效价为1∶2⁶,ELISA效价1∶2⁵,中和抗体效价为1∶20。本研究成功制备了针对H3N2...

【文章页数】：9 页

【文章目录】：
材料与方法
    1 毒株、质粒及细胞系
    2 主要试剂
    3 实验动物及CIV感染
    4 外周血淋巴细胞RNA的提取及反转录
    5 克隆及鉴定可变区基因
        5.1 引物的设计与合成
        5.2 VH、VL及Fc基因的克隆
    6 克隆及鉴定单链抗体基因
        6.1 引物设计与合成
        6.2 克隆单链抗体及Fc基因
    7 表达与鉴定单链抗体scfv和Fc片段
        7.1 构建pET-32a-scFv、pET-32a-Fc和pET-32a-scFv-Fc重组表达载体
        7.2 诱导表达scFv、Fc和scFv-Fc蛋白
        7.3 蛋白纯化及Western Blot鉴定
        7.4 血凝抑制活性检测
        7.5 ELISA检测
        7.6 微量中和试验
结果
    1克隆可变区基因与扩增单链抗体基因
    2重组蛋白scFv、Fc和scFv-Fc的纯化及鉴定
    3 scFv及scFv-Fc蛋白的血凝抑制效价
    4间接ELISA测定scFv及scFv-Fc的活性
    5 scFv与scFv-Fc的中和效价
讨论



本文编号：3996099