断奶仔猪大肠杆菌F18菌株抗性候选基因的筛选与功能分析
发布时间：2024-11-03 12:41
断奶仔猪腹泻和水肿病是规模猪场危害最为严重的疾病之一,产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是造成断奶仔猪腹泻的主要病原菌,产Vero细胞毒素大肠杆菌(Verotoxigenic Escherichia coli, VTEC)则与仔猪水肿病密切相关。国外学者前期研究表明,α-(1,2)岩藻糖转移酶基因1(FUT1)与E.coliF18受体基因相连锁,可以作为控制E.coliF18粘附的候选基因。FUT1基因M307处存在G/A突变位点,并且G对A为显性,即AA基因型猪对E.coliF18表现为抗性,GG型和AG型表现为敏感性,并据此在国外猪种中实现了抗病育种。然而,在国内地方猪种中均未检测到FUT1基因M307AA和AG基因型个体,全部为GG基因型,呈极端偏态分布,由此可见,中外猪种在抗E.coliF18感染过程中具有不同的遗传机理。 课题组在前期研究中利用在苏太猪群体中检测到的少量FUT1基因AG型个体进行适当选种选配,通过多年选育,已在苏太猪中建立了大肠杆菌病抗性(AA型)和敏感性(AG和GG型)资源家系群体。此外,课题...
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1 断奶仔猪腹泻与水肿病研究简介
1.1 断奶仔猪腹泻与水肿病流行病学
1.2 造成断奶仔猪腹泻与水肿病的原因
1.3 大肠杆菌F18菌株致病机理
1.4 大肠杆菌F18菌株黏附受体研究进展
1.5 中外猪种F18大肠杆菌抗性遗传基础的差异
1.6 苏太猪及苏太猪极端表型资源家系群体简介
2 基因芯片
2.1 基因芯片的产生
2.2 基因芯片基本技术原理
2.2.1 基因芯片目标样本的制备
2.2.2 靶基因的杂交及其信号的检测
2.3 Agilent猪4x44K全基因组芯片简介
2.4 芯片数据的处理和生物信息学分析
3 差异蛋白质组学
3.1 蛋白质组学及差异蛋白质组学发展简介
3.2 二维凝胶电泳
3.3 肽质量指纹图谱鉴定蛋白质技术及数据分析
3.4 串联质谱鉴定蛋白质技术及数据分析
3.5 差异蛋白质组学在生物医学上的应用
4 本研究的目的和意义
第二章 断奶仔猪F18大肠杆菌抗性和敏感性个体十二指肠差异基因的筛选与验证
第一节 苏太猪F18大肠杆菌抗性和敏感性全同胞个体的确定和验证
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试剂
1.1.4 主要试剂的配制
1.2 实验方法
1.2.1 猪耳组织DNA提取
1.2.2 引物设计
1.2.3 PCR-RFLP分析
1.2.4 V型分泌系统展呈功能性黏附素和受体结合试验
2 结果与分析
2.1 FUT1基因PCR扩增产物结果
2.2 FUT1基因RFLP酶切结果
2.3 所获取样本E.coli F18感染状态的检测结果
2.4 苏太猪资源群体8个全同胞家系中实验个体的选择
第二节 苏太猪F18大肠杆菌抗性和敏感性对比组基因芯片检测
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试剂
1.2 实验方法
1.2.1 组织RNA的提取
1.2.2 总RNA的纯化(QIAGEN RNeasy(?) Mini Kit)
1.2.3 cDNA第一链和第二链一步法合成
1.2.4 aaUTP标记cRNA合成
1.2.5 cRNA纯化(QIAGEN RNeasy(?) Mini Kit)
1.2.6 cRNA浓度测定
1.2.7 cRNA样品荧光标记
1.2.8 荧光标记cRNA样品纯化(QIAGEN RNeasy(?) Mini Kit)
1.2.9 荧光分子浓度及掺入率计算
1.2.10 cRNA样品片段化和芯片杂交(4x44K microarrays)
1.2.11 芯片扫描
2 相关软件及统计方法
2.1 相关软件
2.2 统计方法
2.2.1 两组间差异基因的筛选——TwoclassDif
2.2.2 基因功能的显著性分析——GO-Analysis
2.2.3 Pathway的显著性分Pathway-Analysis
3 结果与分析
3.1 芯片杂交质控分析结果
3.2 芯片分析结果
3.2.1 大肠杆菌F18菌株敏感性(GG)和抗性(AA)组基因芯片结果分析
3.2.1.1 GG-AA组差异基因筛选
3.2.1.2 GG-AA组差异基因Gene Ontology功能注释
3.2.1.3 GG-AA组差异基因Pathway分析
3.2.2 大肠杆菌F18菌株敏感性(AG)和抗性(AA)组基因芯片结果分析
3.2.2.1 AG-AA组差异基因筛选
3.2.2.2 AG-AA组差异基因Gene Ontology功能注释
3.2.2.3 AG-AA组差异基因Pathway分析
3.3 GG-AA组和AG-AA组基因芯片综合分析结果
3.3.1 GG-AA组和AG-AA组差异基因综合分析
3.3.2 GG-AA组和AG-AA组差异基因GO功能注释及Pathway综合分析
第三节 荧光定量对基因芯片结果的验证
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试剂
1.2 实验方法
1.2.1 猪十二指肠组织RNA的提取
1.2.1.1 提取RNA的准备工作
1.2.1.2 Trizol法提取组织总RNA
1.2.2 RNA的检测
1.2.2.1 NANODROP 1000浓度测定仪检测RNA的浓度和纯度
1.2.2.2 2.2mol/L甲醛的琼脂糖凝胶的制备
1.2.2.3 RNA甲醛变性电泳检测
1.2.3 荧光定量引物设计和PCR扩增
1.2.4 mRNA反转录
1.2.5 目的基因和内参基因片段的PCR扩增
1.2.6 实验方法组织RNA的提取
1.2.7 实时荧光定量PCR
1.3 统计软件和方法
2 结果与分析
2.1 RNA的提取结果
2.2 目的基因和内参基因的溶解曲线
2.3 荧光定量对基因芯片验证结果
3 讨论
第三章 SLA-1和SLA-3基因以及鞘糖脂生物合成—球系列通路基因在F18大肠杆菌抗性和敏感性个体间的表达分析
第一节 SLA-1和SLA-3基因在F18大肠杆菌抗性和敏感性个体内表达分析
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试剂
1.2 实验方法
1.2.1 猪各组织RNA的提取
1.2.2 多重PCR检测断奶仔猪粪便中大肠杆菌毒素基因
1.2.3 荧光定量引物设计和PCR扩增
1.2.4 荧光定量实验
1.3 统计软件和方法
2 结果与分析
2.1 RNA的提取结果
2.2 毒素基因检测结果
2.3 所取样本E.coli F18抗性与敏感性状态的检测结果
2.4 SLA-1和SLA-3基因扩增曲线与溶解曲线
2.5 SLA-1和SLA-3基因的组织表达谱
2.6 SLA-1和SLA-3基因在E.coli F18抗性组和敏感组之间表达比较
2.7 SLA-1和SLA-3基因在E.coli F18抗性组和敏感组内的线性关系分析
2.8 SLA-1和SLA-3基因的GO和Pathway分析
3 讨论
第二节 鞘糖脂生物合成—球系列通路关键基因对猪F18大肠杆菌抗性调控机理分析
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试
1.2 实验方法
1.2.1 猪各组织RNA的提取
1.2.2 通路中关键基因荧光定量引物设计
1.2.3 荧光定量实验
1.3 统计软件和方法
2 结果与分析
2.1 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7个基因组织表达谱
2.2 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7个基因在苏太猪E.coli F18抗性和敏感性个体十二指肠和空肠组织表达比较
2.3 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7个基因在苏太猪E.coli F18抗性个体十二指肠和空肠中相关性分析
2.4 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7个基因在苏太猪E.coli F18敏感性个体十二指肠和空肠中相关性分析
3 讨论
第四章 F18大肠杆菌抗性和敏感型断奶仔猪十二指肠差异蛋白的筛选鉴定及生物信息学分析
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试剂
1.1.4 主要试剂的配制
1.2 实验方法
1.2.1 猪十二指肠蛋白质的提取
1.2.2 蛋白质的定量
1.2.3 双向电泳
1.2.3.1 加样品水化
1.2.3.2 第一向等电聚焦(IEF)
1.2.3.3 IPG胶条的平衡
1.2.3.4 第二向SDS-PAGE电泳
1.2.4 染色
1.2.5 双向电泳图谱扫描与分析
1.2.6 差异表达蛋白的酶解及质谱分析
1.2.7 差异蛋白的生物信息学分析
1.2.8 蛋白间的信号转导网络——Signal-Net
2 结果与分析
2.1 E.coli F18抗性和敏感性个体十二指肠蛋白质电泳图谱分析
2.2 E.coli F18抗性和敏感性两组间个体十二指肠蛋白质的表达变化
2.3 F18大肠杆菌抗性和敏感性个体间十二指肠差异表达蛋白的质谱分析
2.4 差异蛋白生物信息学分析
2.4.1 Gene Ontology和Pathway分析
2.4.2 差异蛋白间相互作用网络图(Signal-Net)分析
3 讨论
全文结论
创新点
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表学术论文
参与申请国家发明专利
本文编号：4011289
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1 断奶仔猪腹泻与水肿病研究简介
1.1 断奶仔猪腹泻与水肿病流行病学
1.2 造成断奶仔猪腹泻与水肿病的原因
1.3 大肠杆菌F18菌株致病机理
1.4 大肠杆菌F18菌株黏附受体研究进展
1.5 中外猪种F18大肠杆菌抗性遗传基础的差异
1.6 苏太猪及苏太猪极端表型资源家系群体简介
2 基因芯片
2.1 基因芯片的产生
2.2 基因芯片基本技术原理
2.2.1 基因芯片目标样本的制备
2.2.2 靶基因的杂交及其信号的检测
2.3 Agilent猪4x44K全基因组芯片简介
2.4 芯片数据的处理和生物信息学分析
3 差异蛋白质组学
3.1 蛋白质组学及差异蛋白质组学发展简介
3.2 二维凝胶电泳
3.3 肽质量指纹图谱鉴定蛋白质技术及数据分析
3.4 串联质谱鉴定蛋白质技术及数据分析
3.5 差异蛋白质组学在生物医学上的应用
4 本研究的目的和意义
第二章 断奶仔猪F18大肠杆菌抗性和敏感性个体十二指肠差异基因的筛选与验证
第一节 苏太猪F18大肠杆菌抗性和敏感性全同胞个体的确定和验证
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试剂
1.1.4 主要试剂的配制
1.2 实验方法
1.2.1 猪耳组织DNA提取
1.2.2 引物设计
1.2.3 PCR-RFLP分析
1.2.4 V型分泌系统展呈功能性黏附素和受体结合试验
2 结果与分析
2.1 FUT1基因PCR扩增产物结果
2.2 FUT1基因RFLP酶切结果
2.3 所获取样本E.coli F18感染状态的检测结果
2.4 苏太猪资源群体8个全同胞家系中实验个体的选择
第二节 苏太猪F18大肠杆菌抗性和敏感性对比组基因芯片检测
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试剂
1.2 实验方法
1.2.1 组织RNA的提取
1.2.2 总RNA的纯化(QIAGEN RNeasy(?) Mini Kit)
1.2.3 cDNA第一链和第二链一步法合成
1.2.4 aaUTP标记cRNA合成
1.2.5 cRNA纯化(QIAGEN RNeasy(?) Mini Kit)
1.2.6 cRNA浓度测定
1.2.7 cRNA样品荧光标记
1.2.8 荧光标记cRNA样品纯化(QIAGEN RNeasy(?) Mini Kit)
1.2.9 荧光分子浓度及掺入率计算
1.2.10 cRNA样品片段化和芯片杂交(4x44K microarrays)
1.2.11 芯片扫描
2 相关软件及统计方法
2.1 相关软件
2.2 统计方法
2.2.1 两组间差异基因的筛选——TwoclassDif
2.2.2 基因功能的显著性分析——GO-Analysis
2.2.3 Pathway的显著性分Pathway-Analysis
3 结果与分析
3.1 芯片杂交质控分析结果
3.2 芯片分析结果
3.2.1 大肠杆菌F18菌株敏感性(GG)和抗性(AA)组基因芯片结果分析
3.2.1.1 GG-AA组差异基因筛选
3.2.1.2 GG-AA组差异基因Gene Ontology功能注释
3.2.1.3 GG-AA组差异基因Pathway分析
3.2.2 大肠杆菌F18菌株敏感性(AG)和抗性(AA)组基因芯片结果分析
3.2.2.1 AG-AA组差异基因筛选
3.2.2.2 AG-AA组差异基因Gene Ontology功能注释
3.2.2.3 AG-AA组差异基因Pathway分析
3.3 GG-AA组和AG-AA组基因芯片综合分析结果
3.3.1 GG-AA组和AG-AA组差异基因综合分析
3.3.2 GG-AA组和AG-AA组差异基因GO功能注释及Pathway综合分析
第三节 荧光定量对基因芯片结果的验证
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试剂
1.2 实验方法
1.2.1 猪十二指肠组织RNA的提取
1.2.1.1 提取RNA的准备工作
1.2.1.2 Trizol法提取组织总RNA
1.2.2 RNA的检测
1.2.2.1 NANODROP 1000浓度测定仪检测RNA的浓度和纯度
1.2.2.2 2.2mol/L甲醛的琼脂糖凝胶的制备
1.2.2.3 RNA甲醛变性电泳检测
1.2.3 荧光定量引物设计和PCR扩增
1.2.4 mRNA反转录
1.2.5 目的基因和内参基因片段的PCR扩增
1.2.6 实验方法组织RNA的提取
1.2.7 实时荧光定量PCR
1.3 统计软件和方法
2 结果与分析
2.1 RNA的提取结果
2.2 目的基因和内参基因的溶解曲线
2.3 荧光定量对基因芯片验证结果
3 讨论
第三章 SLA-1和SLA-3基因以及鞘糖脂生物合成—球系列通路基因在F18大肠杆菌抗性和敏感性个体间的表达分析
第一节 SLA-1和SLA-3基因在F18大肠杆菌抗性和敏感性个体内表达分析
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试剂
1.2 实验方法
1.2.1 猪各组织RNA的提取
1.2.2 多重PCR检测断奶仔猪粪便中大肠杆菌毒素基因
1.2.3 荧光定量引物设计和PCR扩增
1.2.4 荧光定量实验
1.3 统计软件和方法
2 结果与分析
2.1 RNA的提取结果
2.2 毒素基因检测结果
2.3 所取样本E.coli F18抗性与敏感性状态的检测结果
2.4 SLA-1和SLA-3基因扩增曲线与溶解曲线
2.5 SLA-1和SLA-3基因的组织表达谱
2.6 SLA-1和SLA-3基因在E.coli F18抗性组和敏感组之间表达比较
2.7 SLA-1和SLA-3基因在E.coli F18抗性组和敏感组内的线性关系分析
2.8 SLA-1和SLA-3基因的GO和Pathway分析
3 讨论
第二节 鞘糖脂生物合成—球系列通路关键基因对猪F18大肠杆菌抗性调控机理分析
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试
1.2 实验方法
1.2.1 猪各组织RNA的提取
1.2.2 通路中关键基因荧光定量引物设计
1.2.3 荧光定量实验
1.3 统计软件和方法
2 结果与分析
2.1 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7个基因组织表达谱
2.2 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7个基因在苏太猪E.coli F18抗性和敏感性个体十二指肠和空肠组织表达比较
2.3 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7个基因在苏太猪E.coli F18抗性个体十二指肠和空肠中相关性分析
2.4 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7个基因在苏太猪E.coli F18敏感性个体十二指肠和空肠中相关性分析
3 讨论
第四章 F18大肠杆菌抗性和敏感型断奶仔猪十二指肠差异蛋白的筛选鉴定及生物信息学分析
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 主要实验仪器
1.1.3 主要实验试剂
1.1.4 主要试剂的配制
1.2 实验方法
1.2.1 猪十二指肠蛋白质的提取
1.2.2 蛋白质的定量
1.2.3 双向电泳
1.2.3.1 加样品水化
1.2.3.2 第一向等电聚焦(IEF)
1.2.3.3 IPG胶条的平衡
1.2.3.4 第二向SDS-PAGE电泳
1.2.4 染色
1.2.5 双向电泳图谱扫描与分析
1.2.6 差异表达蛋白的酶解及质谱分析
1.2.7 差异蛋白的生物信息学分析
1.2.8 蛋白间的信号转导网络——Signal-Net
2 结果与分析
2.1 E.coli F18抗性和敏感性个体十二指肠蛋白质电泳图谱分析
2.2 E.coli F18抗性和敏感性两组间个体十二指肠蛋白质的表达变化
2.3 F18大肠杆菌抗性和敏感性个体间十二指肠差异表达蛋白的质谱分析
2.4 差异蛋白生物信息学分析
2.4.1 Gene Ontology和Pathway分析
2.4.2 差异蛋白间相互作用网络图(Signal-Net)分析
3 讨论
全文结论
创新点
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附录
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攻读学位期间发表学术论文
参与申请国家发明专利
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