非洲爪蟾卵母细胞抽提物诱导和牛体细胞重编程及其对核移植胚胎生产效率影响
发布时间：2024-12-07 00:29
体细胞核移植已有近20年的发展历史，但其总效率仍然很低。目前认为是高度分化的体细胞在卵母细胞质中重编程不完全，表观遗传修饰异常所致。本研究采用非洲爪蟾卵母细胞抽提物诱导和牛胎儿成纤维细胞重编程，使其恢复到一个较低的分化状态；并以发生重编程的细胞为核供体进行体细胞核移植，研究其对总效率的影响。 1.爪蟾卵母细胞抽提物的提取 通过超数排卵获得爪蟾卵母细胞，10000rpm离心获得M期爪蟾卵母细胞抽提物，蛋白含量分析显示，三次提取的抽提物蛋白浓度均为25-35μg/μL。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，三次提取抽提物所包含蛋白种类一致，成功建立爪蟾卵母细胞抽提物提取体系。 2.抽提物诱导供体细胞的重编程 本研究采集40日龄和牛胎儿的皮肤组织，采用组织块贴壁法建立和牛胎儿成纤维细胞系。通过绘制细胞生长曲线和分析染色体核型，结果显示该细胞系在3-6d细胞处于对数生长期，染色体倍型正常（2n=60）说明细胞系具有良好的生长状态。 应用细胞膜透化剂digitonin对获得的和牛胎儿成纤维细胞进行通透处理，筛选出透化剂最适浓度为7μg/mL，PI染色显示透化效率为55%。然后将非洲...
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 细胞核移植研究进展
1.2 核移植技术的应用前景
1.3 体细胞核移植的重编程
1.3.1 DNA 甲基化
1.3.2 组蛋白乙酰化
1.4 抽提物诱导体细胞重编程
1.4.1 诱导体细胞重编程的经典方法
1.4.2 细胞抽提物诱导
1.4.3 抽提物诱导重编程的进展
1.4.4 抽提物诱导在动物克隆上的应用
1.5 本研究的目的与意义
第二章 爪蟾卵母细胞抽提物的提取
前言
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物
2.1.2 试验仪器
2.1.3 主要试剂、溶液配制
2.2 试验方法
2.2.1 非洲爪蟾超数排卵
2.2.2 爪蟾卵母细胞内容物提取
2.2.3 蛋白浓度的检测
2.2.4 SDS-PAGE 电泳
2.3 试验结果
2.3.1 爪蟾超数排卵
2.3.2 爪蟾卵母细胞内容物提取
2.3.3 抽提物蛋白含量测定
2.3.4 抽提物聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 爪蟾卵母细胞抽提物诱导和牛胎儿成纤维细胞重编程
前言
3.1 试验材料
3.1.1 细胞
3.1.2 试验仪器
3.1.3 主要试剂、溶液配制
3.2 试验方法
3.2.1 胎儿成纤维细胞培养
3.2.2 生长曲线绘制和核型分析
3.2.3 细胞透化浓度筛选
3.2.4 抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞
3.2.5 H3K9 相对免疫荧光染色
3.2.6 碱性磷酸酶染色
3.2.7 Oct4 免疫荧光染色
3.2.8 western blot 分析
3.2.9 PCR 和 qPCR 检测
3.3 试验结果
3.3.1 和牛胎儿成纤维细胞系的建立和培养
3.3.2 胎儿成纤维细胞的生物学观察
3.3.3 透化剂浓度的筛选
3.3.4 抽提物处理牛胎儿成纤维细胞
3.3.5 H3K9 免疫荧光染色
3.3.6 碱性磷酸酶染色
3.3.7 Oct4 蛋白的表达分析
3.3.8 抽提物处理细胞中多能性相关基因的表达检测
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 重编程和牛胎儿成纤维细胞克隆胚胎的制备
前言
4.1 试验材料
4.1.1 试验仪器
4.1.2 主要试剂、溶液
4.2 试验方法
4.2.1 显微操作针的制备
4.2.2 牛卵母细胞体外成熟培养
4.2.3 供体细胞准备
4.2.4 卵母细胞去核
4.2.5 无透明带融合法构建重构胚
4.2.6 重构胚激活与培养
4.3 试验结果
4.3.1 卵母细胞去核
4.3.2 供体细胞准备
4.3.3 无透明带卵母细胞的融合
4.3.4 不同激活方式对克隆效率影响
4.3.5 不同供体细胞对克隆效率的影响
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：4014498
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 细胞核移植研究进展
1.2 核移植技术的应用前景
1.3 体细胞核移植的重编程
1.3.1 DNA 甲基化
1.3.2 组蛋白乙酰化
1.4 抽提物诱导体细胞重编程
1.4.1 诱导体细胞重编程的经典方法
1.4.2 细胞抽提物诱导
1.4.3 抽提物诱导重编程的进展
1.4.4 抽提物诱导在动物克隆上的应用
1.5 本研究的目的与意义
第二章 爪蟾卵母细胞抽提物的提取
前言
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物
2.1.2 试验仪器
2.1.3 主要试剂、溶液配制
2.2 试验方法
2.2.1 非洲爪蟾超数排卵
2.2.2 爪蟾卵母细胞内容物提取
2.2.3 蛋白浓度的检测
2.2.4 SDS-PAGE 电泳
2.3 试验结果
2.3.1 爪蟾超数排卵
2.3.2 爪蟾卵母细胞内容物提取
2.3.3 抽提物蛋白含量测定
2.3.4 抽提物聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 爪蟾卵母细胞抽提物诱导和牛胎儿成纤维细胞重编程
前言
3.1 试验材料
3.1.1 细胞
3.1.2 试验仪器
3.1.3 主要试剂、溶液配制
3.2 试验方法
3.2.1 胎儿成纤维细胞培养
3.2.2 生长曲线绘制和核型分析
3.2.3 细胞透化浓度筛选
3.2.4 抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞
3.2.5 H3K9 相对免疫荧光染色
3.2.6 碱性磷酸酶染色
3.2.7 Oct4 免疫荧光染色
3.2.8 western blot 分析
3.2.9 PCR 和 qPCR 检测
3.3 试验结果
3.3.1 和牛胎儿成纤维细胞系的建立和培养
3.3.2 胎儿成纤维细胞的生物学观察
3.3.3 透化剂浓度的筛选
3.3.4 抽提物处理牛胎儿成纤维细胞
3.3.5 H3K9 免疫荧光染色
3.3.6 碱性磷酸酶染色
3.3.7 Oct4 蛋白的表达分析
3.3.8 抽提物处理细胞中多能性相关基因的表达检测
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 重编程和牛胎儿成纤维细胞克隆胚胎的制备
前言
4.1 试验材料
4.1.1 试验仪器
4.1.2 主要试剂、溶液
4.2 试验方法
4.2.1 显微操作针的制备
4.2.2 牛卵母细胞体外成熟培养
4.2.3 供体细胞准备
4.2.4 卵母细胞去核
4.2.5 无透明带融合法构建重构胚
4.2.6 重构胚激活与培养
4.3 试验结果
4.3.1 卵母细胞去核
4.3.2 供体细胞准备
4.3.3 无透明带卵母细胞的融合
4.3.4 不同激活方式对克隆效率影响
4.3.5 不同供体细胞对克隆效率的影响
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：4014498
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/4014498.html
最近更新
教材专著
