λRed重组和CRISPR/Cas 9技术在构建禽病原性大肠杆菌ahpF、yfgC基因突变株中的运用

发布时间：2025-01-01 05:12

　　大肠杆菌是温血动物包括人在内的肠道中的正常菌群之一,大部分为非致病性菌株,少数则具有致病性。致病性大肠杆菌可分为肠道致病性大肠杆菌和肠道外致病性大肠杆菌(ExPEC)两大类,禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic E.coli, APEC)属于ExPEC的成员,定植于肠道外,可以引发禽的局部感染或全身感染性疾病-大肠杆菌病。禽大肠杆菌病已成为最严重的细菌性传染病之一,给全球养禽业带来了严重的经济损失。已发现APEC拥有多种致病因子,并且还有新的致病因子在不断地被发现被研究。基因突变是研究基因功能的重要技术手段。抗氧化防御系统是细菌保护自身免受代谢过程中产生的过氧化物损伤的一种保护性机制,ahpF基因就是抗氧化防御系统中的一员,它与ahpC一起作用将内源性H202催化成相应的醇和H20,从而清除代谢过程中产生的H2O2,以减少对细菌自身的伤害。另一个研究的基因yfgC和细菌的外膜蛋白保持着紧密的联系,它可以降解错误折叠的外膜蛋白,对细菌外膜蛋白的完整性起到重要的作用。但是目前来说,它的具体作用机制尚不清楚。本研究旨在研究ahpF, yfgC基因与APEC致病性之间的关系,为揭示...

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
第一章 文献综述
    一 关于禽大肠杆菌的研究进展
        1 禽大肠杆菌概述
            1.1 禽大肠杆菌病的临床症状
            1.2 禽致病性大肠杆菌病的流行特点和防治措施
        2 大肠杆菌的血清型
        3 禽致病性大肠杆菌的主要毒力因子
            3.1 抗血清活性因子
            3.2 黏附素(Adhesin)
            3.3 铁摄取系统
            3.4 温度敏感性血凝素(TSH)
            3.5 志贺毒素
        4 目的基因的研究背景
            4.1 ahpF的研究背景
            4.2 yfgC的研究背景
    二 两种突变技术的研究进展
        1 Red重组技术的研究进展
            1.1 Red重组系统的组成
            1.2 Red同源重组相关质粒的介绍
            1.3 Red同源重组系统的发展趋势
        2 CRISPR/Cas系统的研究进展
            2.1 CRISPR/Cas系统的研究历史
            2.2 CRISPR/Cas的基因座结构
            2.3 CRISPR/Cas系统的机制
            2.4 CRISPR/Cas系统构建突变株
第二章 λRed重组和CRISPR/Cas技术在构建禽病原性大肠杆菌ahpF、yfgC基因突变株中的运用
    1 材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 分子生物学及数据分析软件
        1.5 试验动物
    2 用λRed重组系统构建ahpF、yfgC突变株
        2.1 质粒pMD-T-ahpF-Cat、pMD-T-yfgC-Cat重组质粒的构建
        2.2 E058ΔahpF-1、E058ΔyfgC-1突变株的构建
        2.3 突变株抗性基因的去除
    3 用CRISPR/Cas重组系统构建ahpF、yfgC突变株
        3.1 gRNA的设计
        3.2 CRISPR/Cas突变株的构建
        3.3 质粒的消除
    4 突变株生物学特性的研究
        4.1 生长曲线的测定
        4.2 SPF鸡血清杀菌试验
        4.3 体外竞争试验
        4.4 基因组DNA去除鉴定和cDNA的PCR鉴定
    5 突变株的回复拯救实验
        5.1 ahpF回复基因片段的扩增
        5.2 yfgC回复基因片段的扩增
        5.3 重组质粒pACYC184-ahpF、pACYC184-yfgC的构建
        5.4 电转化E058ΔahpF和E058ΔyfgC有抗突变株获得其回复拯救株
    6 突变菌株的致病性实验
        6.1 半数致死量(LD₅₀)试验
        6.2 体内动态分布试验
    7 结果
        7.1 质粒pMD-T-ahpF-Cat、pMD-T-yfgC-Cat片段的鉴定结果
        7.2 重叠PCR片段的鉴定
        7.3 构建的突变株的鉴定
        7.4 RT-PCR结果
        7.5 突变株的回复拯救结果
        7.6 突变株生物学特性的研究结果
    8 讨论
全文总结
参考文献
致谢



本文编号：4022086