猪伪狂犬病病毒gE基因在昆虫细胞中的表达及阻断gE-ELISA方法的建立

发布时间：2017-05-28 09:07

  本文关键词：猪伪狂犬病病毒gE基因在昆虫细胞中的表达及阻断gE-ELISA方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪伪狂犬病是一种主要引起公猪不育、母猪流产死胎、新生仔猪大量死亡、育肥猪生长停滞的一种危害全球养猪业的重大传染病之一。近些年来,伪狂犬病在我国呈爆发流行趋势,给我国养猪业带来巨大损失。gE基因是伪狂犬病毒11个囊膜糖蛋白中一个十分重要的毒力蛋白基因。当前市场上PRV大部分的弱毒疫苗和灭活疫苗均有缺失gE基因,但因为伪狂犬具有潜伏感染性,单纯使用疫苗并不能根除PRV。因此,结合相应的区分野毒感染猪和疫苗免疫猪的鉴别诊断方法,坚决淘汰PRV野毒感染猪是根除伪狂犬的根本措施。目前,我国的PRV野毒鉴别诊断主要依赖于进口国外昂贵的试剂盒,开发出能准确鉴别PRV野毒的国产诊断试剂盒十分必要。本研究通过将PRV gE基因克隆至pFastBac/HBM-TOPO载体,转化含有杆状病毒穿梭质粒的DH10BacTM E.coli,通过三重抗性和蓝白斑筛选,得到含有PRV gE基因的重组Bacmid,将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。分别用间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot方法,对重组杆状病毒表达的蛋白进行鉴定和分析,结果表明:g E蛋白在Sf9细胞中得到高效表达,并且具有良好反应原性。使用经过蔗糖梯度密度离心纯化的PRV病毒免疫6-8周龄BALB/c小鼠,4次免疫后取小鼠脾细胞进行细胞融合,以表达gE蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经过三次亚克隆获得了3株稳定分泌gE单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1H1、7D4、5F2。通过相对亲和力测定和IFA效价检测,结果1H1单抗和gE蛋白的相对亲和力最强,IFA的效价最高,达1:1600。对1H1单抗的生物学特性鉴定表明:其染色体数目正常,抗体亚类其重链为IgG1,轻链为κ。IFA特异性鉴定表明其具有良好的特异性。采用改良过碘酸钠法将1H1 gE单抗进行HRP酶标记,以gE蛋白作为包被抗原,建立了PRV gE阻断ELISA方法。对常见的猪病毒病CSFV、PPV、PRRSV、JEV的标准阳性血清进行检测,结果检测均为阴性,表明本方法具有良好的特异性。和IDEXX PRV gpI抗体检测试剂盒的敏感性对比试验显示:本方法具有较好的敏感性。对238份临床血清样品的检测结果表明:本方法与国外IDEXX PRV gpI抗体检测试剂盒总体符合率达到了90.34%。综上,本方法可用于PRV野毒感染和疫苗毒免疫的鉴别诊断,为我国准确鉴别伪狂犬野毒的gE-ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。
【关键词】：猪伪狂犬病 gE基因 杆状病毒表达 单克隆抗体 阻断ELISA
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 致谢4-7
• 摘要7-8
• 文献综述8-17
• 1 伪狂犬病概述8-9
• 2 伪狂犬病病毒9-11
• 3 猪伪狂犬疫苗研究进展11-13
• 4 猪伪狂犬病野毒感染鉴别诊断方法研究进展13-16
• 5 本研究的目的和意义16-17
• 试验研究17-46
• 试验一：伪狂犬病病毒gE基因在昆虫细胞中的表达17-28
• 1 材料17
• 2 方法17-23
• 3 结果23-26
• 4 讨论26-28
• 试验二：PRV gE单克隆抗体的制备28-38
• 1 材料28
• 2 方法28-33
• 3 结果33-36
• 4 讨论36-38
• 试验三：阻断gE-ELISA方法的建立38-46
• 1 材料38
• 2 方法38-40
• 3 结果40-44
• 4 讨论44-46
• 全文总结46-47
• 参考文献47-55
• 附：作者读研期间发表文章55-56
• 英文缩写词表56-57
• ABSTRACT57-58

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5 拉巴次旦;鲁志平;吴金措姆;;猪伪狂犬病的临床诊断及防治措施[J];西藏科技;2014年02期

6 刘雪萍;;猪伪狂犬病的防治[J];科技致富向导;2007年05期

7 张雪云;;猪伪狂犬病诊断方法研究进展[J];哈尔滨师范大学自然科学学报;2014年01期

8 孙国凤;;防治猪伪狂犬病的活疫苗[J];生物技术通报;1991年10期

9 何启盖,刘正飞,吴斌,姬雅周,黄青伟;猪伪狂犬病的防制研究进展[J];河南畜牧兽医;2000年06期

10 姜艳芬;杨增岐;祝卫国;王旭荣;田小艳;王清爱;;陕西省猪伪狂犬病流行病学调查和WG株的分离鉴定[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2006年09期

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1 张清燕;;猪伪狂犬病研究进展[A];福建省畜牧兽医学会2009年学术年会论文集[C];2009年

2 徐大为;陈玺;;浙江某猪场猪伪狂犬病净化的报告[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（上册）[C];2009年

3 陈怀涛;贾宁;韩庆彦;;猪伪狂犬病的病理诊断[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十一次兽医病理学、第十次动物病理生理学学术研讨会论文集[C];2001年

4 李英霞;于尔松;杨丽丽;邢文杰;朱琪;;黑龙江省种猪场猪伪犬病流行病学调查[A];猪的重要传染病防治研究新成果——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防检疫专业委员会第7次学术交流会论文集[C];2002年

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7 孙广力;孙刚;李书华;郭昭林;杨本;;猪伪狂犬病抗体血清学检测的比较试验[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（上）[C];2003年

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1 石家庄市行唐县兽医防疫站 王金合;仔猪伪狂犬病和链球菌混感咋办[N];河北农民报;2012年

2 刘成文;规模场如何防好猪伪狂犬病[N];中国畜牧兽医报;2013年

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10 陈丙乾;猪伪狂犬病防治[N];农民日报;2004年

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1 王俊杰;河南省猪伪狂犬病流行病学调查及防制经济效益分析[D];吉林大学;2006年

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7 叶华富;2013-2015年江西省部分地区规模化猪场猪伪狂犬病流行病学调查[D];江西农业大学;2016年

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