山羊Boule基因新转录本的鉴定及其功能研究

发布时间：2017-05-28 12:06

  本文关键词：山羊Boule基因新转录本的鉴定及其功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Boule基因是精子减数分裂过程中的一个保守基因,编码RNA结合蛋白,该基因的缺失会阻断精子发生的减数分裂过程,从而导致雄性生殖能力下降。研究表明,Boule基因在人、牛和蝙蝠等哺乳动物上都存在可变剪接(alternative splicing,AS),且其甲基化与犏牛雄性不育有关;然而,目前关于山羊Boule基因的可变剪接及其功能、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和甲基化研究未见报道。因此,本研究以西农萨能奶山羊等不同山羊品种为研究对象,利用DNA测序、实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、重亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)等技术,结合生物信息学方法,鉴定Boule基因的新转录本及其m RNA表达水平,并分析不同转录本与遗传变异、启动子区甲基化修饰的关系。此外,本研究还构建了不同转录本的超表达载体,并转染模式动物小鼠生殖细胞系,分析不同转录本对减数分裂相关基因m RNA表达的影响,从而为深入研究Boule基因的调控机理提供科学资料,为山羊遗传育种与繁殖提供参考。1.山羊Boule基因新转录本的鉴定及其mRNA表达研究由于Boule基因在睾丸组织中特异性表达,故以西农萨能奶山羊睾丸cDNA池为模板,扩增Boule基因CDS区,发现3个新转录本,分别命名为Boule-a,Boule-b和Boule-c。与参考序列(NC_022294)相比,Boule-a缺失第7、8外显子,Boule-b缺失第8外显子,而Boule-c仅保留了第1、2外显子。qRT-PCR揭示Boule基因不同转录本在睾丸组织中差异性表达,Boule-a与Boule-b、Boule-ab的表达量存在显著差异,且Boule-b为Boule基因在睾丸组织中存在的主要转录本形式。2.山羊Boule基因新转录本mRNA表达与遗传变异的关系以西农萨能奶山羊、关中奶山羊、海南黑山羊、内蒙古白绒山羊等不同品种为实验对象,发现山羊Boule基因2个新SNPs位点,分别位于第2内含子(NC_022294:g.7243)和第5内含子(NC_022294:g.12350),而且这些SNPs对山羊生产性状有显著影响(P0.05),可作为山羊生产性状早期选择的分子标记。利用DNA测序法对睾丸个体Boule基因的SNPs位点进行分型,并分析不同转录本mRNA表达量与遗传变异间的关系。结果发现,第5内含子处SNP3-P5(NC_022294:g.12350)位点显著影响Boule-ab总的m RNA表达量(P0.05)。3.山羊Boule基因新转录本mRNA表达与启动子区甲基化的关系Boule基因启动子区在睾丸组织中呈高甲基化状态(90%以上)。相关分析表明,启动子区整体甲基化水平与转录本总mRNA表达量之间呈负相关,且第3个CpG位点(CpG3)和第7个CpG位点(CpG7)位点与转录本a和b总的表达量Boule-ab有显著的相关性(P0.05)。4.山羊Boule基因新转录本对雄性小鼠GC-1细胞减数分裂基因表达的影响分别构建了CD513B-Boule-a和CD513B-Boule-b,CD513B-Boule-c的超表达载体并转染模式动物小鼠的生殖细胞GC-1细胞,同时分析Boule基因不同转录本和减数分裂相关基因表达量的变化。由于Boule-b转录本的超表达载体转染效率低,故只对超表达Boule-a和Boule-c转录本进行分析,结果发现在转染CD513B-Boule-a和CD513B-Boule-c后,减数分裂相关基因CDC2的表达量显著下调(P0.01),推测这两种转录本可能抑制减数分裂。
【关键词】：山羊 Boule基因 可变剪接(AS) 遗传变异 DNA甲基化 功能研究
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 文献综述12-23
• 第一章 可变剪接与Boule基因研究进展12-23
• 1.1 我国山羊产业现状12
• 1.2 可变剪接的研究进展12-16
• 1.2.1 可变剪接的概念和发展12-13
• 1.2.2 可变剪接方式与内含子调控可变剪接机制13-14
• 1.2.3 可变剪接外显子特征14-15
• 1.2.4 可变剪接的功能15-16
• 1.2.5 可变剪接的检测方法16
• 1.3 可变剪接的影响因素16-19
• 1.3.1 可变剪接与遗传变异16-18
• 1.3.2 可变剪接与表观遗传修饰18-19
• 1.4 Boule基因的研究进展19-21
• 1.4.1 Boule基因的结构特征20
• 1.4.2 Boule基因的细胞组织定位20-21
• 1.4.3 Boule基因的功能及研究进展21
• 1.5 本研究的目的和意义21-23
• 试验研究23-61
• 第二章 山羊Boule基因新转录本的鉴定及mRNA表达差异研究23-35
• 2.1 材料与方法23-26
• 2.1.1 试验材料23
• 2.1.2 试验方法23-26
• 2.2 结果与分析26-33
• 2.2.1 总RNA质量检测26
• 2.2.2 山羊Boule基因可变剪接的预测与鉴定26-27
• 2.2.3 生物信息分析27-32
• 2.2.4 不同转录本mRNA表达差异研究32-33
• 2.3 讨论33-34
• 2.4 小结34-35
• 第三章 山羊Boule基因新转录本mRNA表达与遗传变异的关系35-45
• 3.1 材料与方法35-39
• 3.1.1 试验材料35-36
• 3.1.2 试验方法36-39
• 3.2 结果与分析39-42
• 3.2.1 Boule基因的多态性检测39-40
• 3.2.2 Boule基因各SNP位点分型40-41
• 3.2.3 各SNP位点的群体遗传学分析以及与山羊生产性状的关联分析41-42
• 3.2.4 不同转录本m RNA表达与SNP的关系42
• 3.3 讨论42-44
• 3.4 小结44-45
• 第四章 山羊Boule基因新转录本mRNA表达与启动子甲基化的关系45-52
• 4.1 材料与方法45-47
• 4.1.1 试验材料45
• 4.1.2 试验方法45-47
• 4.2 结果与分析47-50
• 4.2.1 TA克隆结果47
• 4.2.2 亚硫酸氢盐（BSP）PCR测序结果及序列比对47-48
• 4.2.3 Boule基因启动子区甲基化模式图48-49
• 4.2.4 不同转录本m RNA表达与DNA甲基化的关系49-50
• 4.3 讨论50-51
• 4.4 小结51-52
• 第五章 山羊Boule基因新转录本对雄性小鼠GC-1 细胞减数分裂基因表达的影响52-61
• 5.1 材料与方法52-56
• 5.1.1 试验材料52
• 5.1.2 试验方法52-56
• 5.2 结果与分析56-59
• 5.2.1 CD513B-cmv U6超表达载体构建56
• 5.2.2 载体转染GC-1 细胞系56-57
• 5.2.3 CD513B-Boule-a和CD513B-Boule-c超表达效率的检测57-58
• 5.2.4 减数分裂相关基因表达分析58-59
• 5.3 讨论59-60
• 5.4 小结60-61
• 结论及创新点61-62
• 本研究得到以下结论61
• 创新点61
• 下一步研究计划61-62
• 参考文献62-72
• 附录72-88
• 致谢88-90
• 个人简介90-91

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