牛Nebovirus的分子检测和基因组研究

发布时间：2025-02-09 19:07

　　Newbury-1 virus目前是杯状病毒科（Caliciviridae family）纽布病毒属（Nebovirus genus）唯一成员,常用Nebovirus（NeV）表述。NeV为单股正链RNA病毒,是致犊牛腹泻的病毒。迄今为止,NeV已经在美国、英国、巴西、土耳其、日本等12个国家检出,具有广泛的地域分布。根据RdRp基因序列,NeV可以分为NB-like、NA1-like和Dijon A216-like 3种基因型;根据完整VP1序列,NeV可以分为2种基因型（基因1型和基因2型）,其中基因1型又细分为4个谱系（谱系1～4）。目前,NeV在我国的存在及流行情况尚不清楚。本研究旨在调查NeV在我国的流行情况及其分子特征,取得了以下成果:1.我国部分地区奶牛NeV的分子检测和基因组研究采集新疆维吾尔自治区、四川省、辽宁省、河南省、山东省和陕西省23个养殖场的307份奶牛粪便样本（237份腹泻粪便样本,70份临床健康粪便样本）,采用RT-PCR方法对NeV进行检测。结果显示,NeV在腹泻粪便样本的检出率（48.1%）显著高于健康粪便样本（5.70%,P<0.001）,场阳性...

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 Nebovirus的研究进展
    1.1 Nebovirus的发现及分类
    1.2 Nebovirus致病性
    1.3 Nebovirus的基因组结构和编码蛋白
    1.4 RdRp的分子特征及功能
        1.4.1 RdRp的分子特征
        1.4.2 RdRp的结构与功能
    1.5 VP1 的分子特征及功能
        1.5.1 VP1 的分子特征
        1.5.2 VP1 的结构与功能
    1.6 Nebovirus的检测技术
        1.6.1 电镜观察
        1.6.2 RT-PCR检测
        1.6.3 基于酶联免疫吸附试验的抗体检测技术
    1.7 Nebovirus的流行现状
    1.8 问题与展望
第2章 我国部分地区奶牛Nebovirus的分子检测和基因组研究
    2.1 材料与方法
        2.1.1 临床样本
        2.1.2 主要试剂和仪器
        2.1.3 病毒RNA的提取及cDNA的合成
        2.1.4 RT-PCR检测Nebovirus
        2.1.5 与轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染
        2.1.6 Nebovirus完整VP1和Rd Rp基因片段的克隆
        2.1.7 Nebovirus完整基因组的克隆
        2.1.8 基因序列分析、遗传进化和重组分析
        2.1.9 统计分析
    2.2 结果
        2.2.1 Nebovirus RT-PCR检测结果
        2.2.2 Nebovirus与轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染
        2.2.3 RdRp基因片段序列分析、遗传进化及重组分析
        2.2.4 完整VP1 基因序列、遗传进化及重组分析
        2.2.5 2 株奶牛Nebovirus完整基因组序列分析、遗传进化及重组分析
    2.3 讨论
        2.3.1 我国奶牛Nebovirus的流行情况
        2.3.2 我国奶牛Nebovirus RdRp分子特征
        2.3.3 Nebovirus VP1 的基因型和谱系
        2.3.4 我国奶牛Nebovirus VP1 分子特征
        2.3.5 我国奶牛Nebovirus基因组特征
    2.4 小结
第3章 牦牛Nebovirus分子检测和基因组研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 临床样本
        3.1.2 主要试剂与仪器
        3.1.3 病毒RNA的提取及cDNA的合成
        3.1.4 RT-PCR检测牦牛Nebovirus
        3.1.5 与轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染
        3.1.6 牦牛Nebovirus完整基因组的克隆
        3.1.7 RT-PCR方法筛选新型Nebovirus
        3.1.8 基因序列分析、遗传进化和重组分析
    3.2 结果
        3.2.1 牦牛Nebovirus的 RT-PCR检测结果
        3.2.2 Nebovirus与轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染
        3.2.3 牦牛Nebovirus RdRp序列和遗传进化分析
        3.2.4 2 株牦牛Nebovirus基因组的特征
        3.2.5 牦牛腹泻样本中新型Nebovirus的 RT-PCR检测结果
    3.3 讨论
        3.3.1 牦牛Nebovirus的流行情况
        3.3.2 新型Nebovirus的基因组特征
        3.3.3 VP1 新基因型的特征
        3.3.4 RdRp新基因型的特征
        3.3.5 新型Nebovirus的流行情况
    3.4 小结
第4章 检测Nebovirus的 Real-time RT-PCR方法的建立
    4.1 材料与方法
        4.1.1 病毒(菌)株核酸和临床样本
        4.1.2 主要试剂及仪器
        4.1.3 引物的设计与合成
        4.1.4 核酸提取
        4.1.5 阳性标准品的制备
        4.1.6 反应体系及条件的优化
        4.1.7 熔解曲线分析和标准曲线的建立
        4.1.8 特异性评价
        4.1.9 敏感性测定
        4.1.10 稳定性评价
        4.1.11 4 种RT-PCR对临床样本中NeV核酸检出率的比较
    4.2 结果
        4.2.1 引物的特异性
        4.2.2 优化的real-time RT-PCR反应体系及条件
        4.2.3 标准曲线及熔解曲线
        4.2.4 方法的特异性
        4.2.5 方法的敏感性
        4.2.6 方法的稳定性
        4.2.7 4 种方法对临床样本的复核率
    4.3 讨论
    4.4 小结
结论与创新点
参考文献
附录一
致谢



本文编号：4032726