早期断奶仔猪肠细胞凋亡分子机理及营养调控研究

发布时间：2025-03-18 06:44

　　早期断奶引起的仔猪早期断奶应激综合症是养猪生产中的大事件，给养猪业带来了巨大的经济损失。早期断奶给仔猪造成的最明显损伤就是导致仔猪肠道屏障功能损伤。有研究证实,细胞凋亡紊乱会导致肠黏膜屏障功能障碍和胃肠功能损伤，而自由基代谢异常与凋亡紊乱密切相关。本课题组前期研究也发现，早期断奶会导致仔猪血清中H2O2和NO含量增加、抗氧化能力降低。但是断奶导致的仔猪自由基代谢异常与肠细胞凋亡及肠屏障功能之间的关系仍未可知。 N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine， NAC），作为一种强有效的抗氧化剂，已广泛应用于临床疾病治疗研究，但对于其能否调控断奶应激仔猪的自由基代谢和肠道细胞凋亡过程，减少肠道屏障损伤，缓解断奶应激综合症及其机理还未见报道，为此，本文开展以下四个研究 1早期断奶过程中仔猪肠道细胞凋亡研究 以酶学ELISA法分析Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性，利用原位缺口末端标记、透射电镜法观察肠组织形态变化，并对凋亡相关基因（Caspase-3、8、9、Bcl-2和Bax基因）进行qRT-PCR表达分析，研究21日龄断奶仔猪肠道细胞的凋亡过程，探...

【文章页数】：174 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
前言
    1 细胞凋亡与肠道功能
        1.1 细胞凋亡的概念
        1.2 细胞凋亡机制
            1.2.1 半胱氨酸蛋白酶的激活与特性
            1.2.2 线粒体途径
            1.2.3 死亡受体途径
            1.2.4 内质网途径
        1.3 细胞凋亡与肠道功能的关系
            1.3.1 细胞凋亡与炎性肠病
            1.3.2 细胞凋亡与肠道癌症
            1.3.3 细胞凋亡与缺血再灌注
    2 氧化应激与细胞凋亡
        2.1 氧化应激和自由基
            2.1.1 线粒体：细胞氧自由基产生的重要场所
            2.1.2 ROS 和氧化损伤
            2.1.3 线粒体：ROS 作用的靶点
        2.2 ROS 和细胞凋亡
            2.2.1 ROS 诱导细胞凋亡的机制
            2.2.2 ROS 和细胞色素 C 释放机制
            2.2.3 心磷脂过氧化调控细胞色素 C 的释放
        2.3 细胞 ROS、氧化还原和抗氧化防御系统
            2.3.1 抗氧化防御系统
            2.3.2 线粒体抗氧化防御系统
    3 肠道抗氧化生物学
        3.1 肠上皮的结构与功能
        3.2 小肠细胞内氧化还原状态和抗氧化防御体系
            3.2.1 细胞氧化还原状态的概念
            3.2.2 谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶系统 (GSH/GSSG)
            3.2.3 硫氧还蛋白氧化还原系统（Trx/TrxSS）
            3.2.4 半胱氨酸氧化还原系统(Cys/CySS)
        3.3 肠道氧化应激与肠道病理学
            3.3.1 肠道氧化应激与细胞的命运：增殖、分化、凋亡
            3.3.2 氧化应激、氧化还原状态与肠道疾病
    4 氧化应激与抗氧化治疗
        4.1 抗氧化治疗与肠道疾病
        4.2 N-乙酰半胱氨酸——GSH 的前体物质
        4.3 早期断奶应激综合症
第一章 仔猪早期断奶过程中肠道细胞凋亡研究
    1 材料与方法
        1.1 试验设计
        1.2 肠组织 DNA Ladder 检测
            1.2.1 试剂及仪器
            1.2.2 肠黏膜 DNA 提取
            1.2.3 电泳
        1.3 空肠组织中凋亡酶含量的测定
            1.3.1 试剂及仪器
            1.3.2 肠道组织匀浆中蛋白含量的测定
            1.3.3 Caspase-3 ELISA 检测
            1.3.4 Caspase-8 ELISA 检测
            1.3.5 Caspase-9 ELISA 检测
        1.4 空肠肠组织 TUNEL 检测
            1.4.1 实验原理
            1.4.2 试剂
            1.4.3 设备
            1.4.4 组织包埋程序
            1.4.5 组织石蜡切片的制作
            1.4.6 肠组织 TUNEL 检测
        1.5 肠细胞透射电镜观察
            1.5.1 原理
            1.5.2 试剂材料
            1.5.3 操作步骤
        1.6 肠组织凋亡相关基因实时荧光定量 PCR 检测
            1.6.1 试剂及仪器
            1.6.2 总 RNA 的提取
            1.6.3 凋亡相关基因荧光定量 PCR
    2 结果与分析
        2.1 肠组织 DNA Ladder 检测
        2.2 早期断奶对仔猪空肠组织中凋亡酶含量的影响
        2.3 早期断奶对仔猪空肠肠细胞凋亡的影响
        2.4 透射电镜检测早期断奶对仔猪空肠肠细胞形态结构的影响
        2.5 凋亡相关基因实时荧光定量 PCR 检测
    3 讨论
        3.1 断奶后仔猪肠细胞形态学变化
        3.2 断奶后仔猪肠细胞凋亡分子机理研究
    4 小结
第二章 早期断奶仔猪自由基代谢与肠细胞凋亡及肠屏障功能的关系
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
            1.1.1 试验设计
            1.1.2 试验药品
            1.1.3 实验仪器和设备
        1.2 血清抗氧化指标的测定
            1.2.1 血清中微量 MDA 含量的检测方法
            1.2.2 血清中 SOD 活力的检测方法
            1.2.3 血清中 GSH-Px 活力的检测
            1.2.4 血清中 NO 含量测定
            1.2.5 血清中 H2O2的测定
            1.2.6 血清抑制羟自由基能力检测
        1.3 酶联免疫法检测血清皮质醇、低氧诱导因子及 TNF-α含量
            1.3.1 皮质醇
            1.3.2 低氧诱导因子
            1.3.3 肿瘤坏死因子α
        1.4 肠黏膜通透性检测
            1.4.1 血清 DAO 含量测定
            1.4.2 血清 IFABP 含量测定
        1.5 紧密连接相关基因荧光定量 PCR 检测
            1.5.1 引物设计
            1.5.2 肠组织总 RNA 提取
            1.5.3 紧密连接相关基因荧光定量 PCR 检测
        1.6 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 血清皮质醇、TNF-α和 HIF-1α含量
        2.2 血清 DAO 和 IFABP 测定
        2.3 血清抗氧化指标及自由基含量测定
        2.4 紧密连接相关基因荧光定量 PCR 检测
        2.5 凋亡酶含量与抗氧化指标和自由基含量的相关性分析
    3 讨论
        3.1 早期断奶对仔猪血清皮质醇、HIF-1α和 TNF-α含量的影响
        3.2 早期断奶对仔猪血清 DAO 和 IFABP 含量的影响
        3.3 早期断奶对仔猪血清抗氧化状态的影响
        3.4 早期断奶对仔猪肠黏膜紧密连接相关蛋白表达的影响
    4 小结
第三章 断奶仔猪小肠基因表达谱及细胞凋亡代谢网络分析
    1 材料与方法
        1.1 试验材料：
            1.1.1 实验设计
            1.1.2 试剂及仪器
        1.2 RNA 抽提和纯化
        1.3 芯片实验
            1.3.1 样品 RNA 的放大和标记
            1.3.2 芯片杂交
            1.3.3 芯片扫描
            1.3.4 芯片数据分析
        1.4 细胞周期及凋亡相关基因荧光定量 PCR 验证
            1.4.1 引物设计
            1.4.2 荧光定量 PCR 检测
            1.4.3 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 RNA 样品质控
        2.2 芯片实验质控
            2.2.1 芯片检出率检测
            2.2.2 杂交信号均一性检测
            2.2.3 芯片杂交火山图
            2.2.4 芯片杂交箱线图
            2.2.5 芯片杂交 PCA 图分析
        2.3 差异表达基因筛选结果
        2.4 差异表达基因 heatmap 图
        2.5 差异表达基因 GO 聚类分析
        2.6 差异表达基因 KEGG 代谢途径分析
        2.7 细胞周期及凋亡相关基因实时荧光定量 PCR 验证
        2.8 断奶仔猪主要代谢调控网络
        2.9 细胞周期代谢图绘制
        2.10 免疫调控代谢图绘制
    3. 讨论
        3.1 断奶后仔猪肠组织差异表达基因的筛选
        3.2 断奶后仔猪肠细胞凋亡、增殖及细胞周期调控间的关系
        3.3 断奶后仔猪肠 MAPK、JAK-STAT 途径与细胞周期调控
    4 小结
第四章 N-乙酰半胱氨酸(NAC)对仔猪断奶应激和肠道细胞凋亡的调控作用及其机理
    1 材料与方法
        1.1 试验材料：
            1.1.1 试验设计
            1.1.2 试验仪器
        1.2 血清皮质醇、TNF-α和 HIF-1α含量
        1.3 血清和肝脏抗氧化指标测定
            1.3.1 血清和肝脏 SOD 测定
            1.3.2 血清和肝脏 GSH-PX 活力测定
            1.3.3 血清和肝脏 MDA 含量测定
        1.4 空肠组织 HE 染色
            1.4.1 常规石蜡切片制作
            1.4.2 常规苏木精-伊红染色
        1.5 空肠组织 TUNEL 染色
        1.6 空肠组织透射电镜检测
        1.7 凋亡及细胞周期相关基因 mRNA 表达
    2 结果与分析
        2.1 血清皮质醇、TNF-α和 HIF-1α含量
        2.2 早期断奶对仔猪血清和肝脏组织抗氧化能力的影响
        2.3 早期断奶对仔猪空肠绒毛结构的影响
        2.4 肠组织 TUNEL 检测
        2.5 肠细胞透射电镜观察
        2.6 细胞周期及凋亡相关基因实时荧光定量 PCR 检测
    3 讨论
        3.1 NAC 对断奶仔猪抗氧化能力及应激状态的影响
        3.2 NAC 对断奶仔猪肠细胞凋亡及细胞周期调控
    4 小结
全文总结
参考文献
附录
文章部分缩略词表
本文创新点及有待解决的问题
致谢
攻读博士期间发表的论文



本文编号：4036165