重组猪轮状病毒VP7表达载体的构建与免疫原性分析

发布时间：2025-04-01 06:50

　　 猪轮状病毒（Porcine rotavirus, PoRV）是呼肠孤病毒科,轮状病毒属的成员,本属病毒在世界范围普遍流行,是流行广泛的人兽共患病。目前,研制安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段之一。本研究旨在对猪轮状病毒VP7蛋白在粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的表达,并鉴定其免疫学特性。首先根据GenBank中发表的VP7全序列（NC₀11503.2）设计引物,从含VP7的G-2质粒中扩增目的片段,建立融合表达载体pESP-2-VP7的重组酵母工程菌。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-Dthiogalactoside, IPTG）可诱导表达谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase, GST）-VP7融合蛋白,后将发酵工艺条件优化后的融合蛋白GST-VP7分离纯化并免疫小鼠（Mus musculus）,进行免疫原性的分析。结果显示,克隆的VP7基因与预计的糖蛋白基因大小一致,并在酵母菌中表达了分子质量约61 k D重组蛋白,再经发酵工艺条件优化后,获得蛋白浓度达0.99 mg/...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 菌种与载体
    1.2 主要试剂
    1.3 实验动物
    1.4 扩增目的片段
    1.5 重组酵母表达载体的构建及转化
    1.6 VP7目的蛋白的诱导及表达
    1.7 碳源的选择
    1.8 氮源的选择
    1.9 适宜p H值的确定
    1.1 0 接种量
    1.1 1 蛋白质含量测定
    1.1 2 重组抗原VP7动物免疫实验
    1.1 3 抗体水平ELISA检测
    1.1 4 中和抗体的检测
    1.1 5 利用ELISPOT检测分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴细胞数
    1.16数据分析
2 结果与分析
    2.1 VP7基因的克隆
    2.2 重组表达质粒的PCR、扩增和酶切鉴定
    2.3 VP7蛋白的诱导及表达
    2.4 发酵碳源的优化
    2.5 发酵氮源的优化
    2.6 发酵p H值的优化
    2.7 发酵工艺优化后的蛋白含量测定
    2.8 VP7蛋白免疫小鼠血清Ig G抗体水平
    2.9 VP7蛋白免疫小鼠SIg A抗体水平及中和效价检测
    2.1 0 ELISPOT计数分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴细胞
3 讨论
4 结论



本文编号：4039089