Cullin-2敲除细胞系的构建及其对流感病毒复制的影响

发布时间：2025-03-30 00:40

　　A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染诱导机体产生过度炎症反应,尤其在肺部产生“细胞因子风暴”,其具体机制尚未明确。前期本实验室有研究表明,流感病毒与Cullin-1相关的E3连接酶复合物(CRL1)之间存在互作,且与产生炎性细胞因子的NF-κB通路密切相关。本研究着眼于其他CRL复合体,尤其是CRL2复合体,研究其与流感病毒复制之间的关系,探究Cullin-2影响流感病毒感染宿主的分子调控机制,旨在为流感致病性机制研究提供新的思路。CRL复合物是作为E3连接酶中最大的家族,负责识别底物蛋白并将其泛素化。病毒作为一种结构简单的细胞寄生型生物,常常会利用宿主的CRL复合物,激活、劫持或干扰其底物的降解,创造有利病毒复制的环境。本研究通过分析A型流感病毒Ca09(H1N1)感染A549细胞6小时后的转录组学数据,发现在流感病毒感染后,cullin2、cullin5和CRL激活抑制分子CAND1基因的转录水平显著下调,这表明多种CRL相关基因可能在流感病毒感染早期发挥重要作用。为了研究CRL复合物对流感病毒复制以及对宿主细胞因子表达的影响,本研究根据8种Cullin蛋白...

【文章页数】：65 页

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摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 A型流感病毒的概述
        1.1.1 概述
        1.1.2 流感病毒感染宿主过程
        1.1.3 A型流感病毒的致病性
        1.1.4 流感病毒与天然免疫
    1.2 CRL复合体的概述
        1.2.1 概述
        1.2.2 CRL复合体的结构与功能
        1.2.3 CRL活性的的调节
        1.2.4 CRL与病毒感染
    1.3 CRL复合体与流感病毒关系
    1.4 研究目的与意义
第二章 Cullin-2 敲除细胞系的构建及其对流感病毒复制的影响
    2.1 实验材料
        2.1.1 流感病毒毒株、质粒、细胞株
        2.1.2 实验试剂及溶液配制
        2.1.3 实验仪器
        2.1.4 生物学数据分析软件
    2.2 实验方法
        2.2.1 流感病毒感染细胞转录组学分析
        2.2.2 敲除细胞系的构建与鉴定
        2.2.3 流感病毒感染细胞实验
        2.2.4 流感病毒滴度测定
        2.2.5 蛋白免疫印迹实验
        2.2.6 RNA提取和反转录
        2.2.7 实时荧光定量PCR检测细胞因子
        2.2.8 免疫共沉淀
    2.3 实验结果
        2.3.1 流感病毒感染对CRL相关基因转录组学的影响
        2.3.2 CRL相关基因敲除载体构建
        2.3.3 NAE1、Cullin-1/2/3的sg RNA敲除效果鉴定
        2.3.4 Cullin2 基因敲除细胞系鉴定
        2.3.5 TCID50 测定流感病毒感染KO细胞系的滴度
        2.3.6 Western blot检测CUL2-KO细胞系的流感病毒蛋白表达
        2.3.7 实时荧光定量PCR检测细胞因子转录表达
        2.3.8 CO-IP验证流感病毒相关蛋白与Cullin-2 蛋白的互作
    2.4 讨论
第三章 Cullin-2 KO细胞系的蛋白质组学初步分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞和质粒
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 实验仪器
        3.1.4 生物学数据分析
    3.2 实验方法
        3.2.1 Label Free实验的样品制备和全蛋白质提取
        3.2.2 蛋白质肽段水解
        3.2.3 LC-MS/MS分析液相色谱-质谱分析
        3.2.4 蛋白质鉴定和定量分析
        3.2.5 生物信息学数据分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 Cullin2 基因敲除引起蛋白质的表达差异的鉴定与定量
        3.3.2 差异表达蛋白质GO功能富集分析
        3.3.3 差异表达蛋白质KEGG通路富集分析
        3.3.4 与CRL复合体和流感病毒相关的KEGG通路变化
    3.4 讨论
第四章 结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：4037910