利用CRISPR/Cas9技术构建表达EGFP的两株重组火鸡疱疹病毒rHVT-US2/US10-EGFP

发布时间：2025-04-15 03:20

　　本研究利用CRISPR/Cas9的基因编辑技术建立了火鸡疱疹病毒的载体平台,并拯救获得在US2或US10基因内表达外源基因的重组火鸡疱疹病毒。首先根据HVT FC-126毒株US2基因序列,设计并合成g RNA,并通过双链退火的方式,获得目的片段。目的片段与Bbs1酶切处理后的px330载体连接,获得重组质粒px330-gRNA。通过PCR的方法,分别扩增获得US2的g RNA序列两侧的同源臂A(US2A)和B(US2B)及EGFP编码蛋白的序列,并通过PCR的方法,扩增获得US2A-EGFP-US2B片段。将px330-g RNA和US2A-EGFP-US2B电转入鸡胚成纤维细胞。24h后,将电转的细胞感染HVT FC-126。感染后72h,收集较大荧光簇的细胞。进一步地将收集的细胞团稀释成一定的浓度并接种于新的鸡胚成纤维细胞。通过蚀斑纯化的方法,最终获得了稳定表达EGFP的重组病毒rHVT-US2-EGFP。用同样的方法,也获得了稳定表达EGFP的重组病毒rHVT-US10-EGFP。这些研究结果建立了HVT重组表达载体系统,为后期的拯救稳定表达外源蛋白HVT重组病毒及其应用研究奠定...

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩略语表
1 引言
    1.1 马立克氏病病毒与火鸡疱疹病毒的概述
        1.1.1 马立克氏病病毒与火鸡疱疹病毒基因组结构及形态
        1.1.2 马立克氏病病毒与火鸡疱疹病毒的复制
    1.2 疫苗的概述
    1.3 火鸡疱疹病毒作为病毒载体的优点
    1.4 火鸡疱疹病毒作为活病毒载体的条件
        1.4.1 构建外源基因表达盒
        1.4.2 复制非必需区的选择
        1.4.3 启动子的选择
        1.4.4 重组火鸡疱疹病毒的研究进展
    1.5 同源重组技术
        1.5.1 同源重组技术的概况
        1.5.2 同源重组技术的发展历史
    1.6 CRISPR系统的介绍
        1.6.1 CRISPR系统的结构
        1.6.2 CRISPR系统的类型
        1.6.3 CRISPR/Cas9编辑技术的介绍
        1.6.4 CRISPR/Cas9系统的应用
    1.7 本试验研究目的意义
2 表达EGFP的重组火鸡疱疹病毒rHVT-US2-EGFP的拯救与鉴定
    2.1 材料
        2.1.1 病毒与质粒
        2.1.2 细胞与鸡胚
        2.1.3 主要试剂与试剂盒
        2.1.4 主要实验仪器
    2.2 方法
        2.2.1 设计引物
        2.2.2 px330-gRNA质粒的构建
            2.2.2.1 gRNA双链退火
            2.2.2.2 px330质粒的BbsⅠ单一酶切
            2.2.2.3 酶切产物与双链退火引物快速链接
            2.2.2.4 转化与菌液鉴定
            2.2.2.5 阳性质粒的大量抽提
        2.2.3 重组质粒pUC19-US2A-EGFP-US2B的构建
            2.2.3.1 含US2基因左右臂的重组质粒的构建
            2.2.3.2 鸡胚成纤维细胞(CEF)制备步骤
            2.2.3.3 火鸡疱疹病毒细胞毒的冻存与复苏
            2.2.3.4 火鸡疱疹病毒的增殖
            2.2.3.5 火鸡疱疹病毒的DNA的提取
            2.2.3.6 US2基因左右臂的扩增
            2.2.3.7 目的片段的纯化
            2.2.3.8 目的片段与pSIMPLE19EcoRV/BAPVector载体的连接
            2.2.3.9 连接产物的转化及鉴定
            2.2.3.10 阳性质粒小量提取及测序
            2.2.3.11 US2基因左右同源臂的扩增
            2.2.3.12 pUC19-EGFP表达载体质粒的线性化
            2.2.3.13 pUC19-EGFP质粒双酶切产物的纯化
            2.2.3.14 载体与目的片段进行同源重组
            2.2.3.15 转化及重组质粒的PCR鉴定
            2.2.3.16 线性化同源重组臂
        2.2.4 共转染
            2.2.4.1 次代鸡胚成纤维细胞中脂质体法转染
            2.2.4.2 人肾上皮细胞中脂质体法转染
            2.2.4.3 电转染法
            2.2.4.4 转染条件的优化
            2.2.4.5 重组病毒rHVT-US2-EGFP的筛选
            2.2.4.6 US2重组病毒的鉴定
    2.3 结果
        2.3.1 px330质粒BbsⅠ酶切电泳结果
        2.3.2 px330-gRNA菌液鉴定结果
        2.3.3 US2左右臂菌液鉴定结果
        2.3.4 pUC19-EGFP质粒双酶切实验结果
        2.3.5 US2基因的左右同源臂扩增电泳结果
        2.3.6 线性化重组质粒pUC19-US2A-EGFP-US2B的PCR扩增电泳结果
        2.3.7 电压的优化
        2.3.8 细胞量的优化实验结果
        2.3.9 质粒转染量的优化实验结果
        2.3.10 US2重组病毒的拯救及蚀斑纯化结果
        2.3.11 US2重组病毒的鉴定结果
3 表达EGFP的两株重组火鸡疱疹病毒rHVT-US10-EGFP的拯救与鉴定
    3.1 材料
    3.2 方法
        3.2.1 设计引物
        3.2.2 px330-gRNA质粒的构建
            3.2.2.1 gRNA双链退火
            3.2.2.2 px330质粒的BbsⅠ单一酶切
            3.2.2.3 酶切产物与双链退火引物快速连接
            3.2.2.4 转化与菌液鉴定
            3.2.2.5 阳性质粒的大量抽提
        3.2.3 重组质粒pUC19-US10A-EGFP-US10B的构建
            3.2.3.1 US10基因左右臂的扩增
            3.2.3.2 US10基因左右同源臂的扩增
            3.2.3.3 载体与目的片段进行同源重组
            3.2.3.4 转化及重组质粒的PCR鉴定
            3.2.3.5 线性化同源重组臂
        3.2.4 电转染
        3.2.5 重组病毒rHVT-US10-EGFP的筛选
        3.2.6 US10重组病毒的鉴定
        3.2.7 结果
            3.2.7.1 px330-gRNA菌液鉴定结果
            3.2.7.2 US10左右同源臂菌液鉴定结果
            3.2.7.3 US10左右同源臂扩增电泳图结果
            3.2.7.4 线性化重组质粒pUC19-US10A-EGFP-US10B的PCR扩增电泳结果
            3.2.7.5 US10重组病毒的拯救与蚀斑纯化结果
            3.2.7.6 US10重组病毒的鉴定结果
4 讨论
5 结论
致谢
参考文献
作者简介



本文编号：4039987