野毒株狂犬病毒逃避树突状细胞识别的机制

发布时间：2025-04-18 02:18

　　狂犬病是最古老的传染病之一,全世界每年约有55000人死于狂犬病。狂犬病毒属于弹状病毒科,基因组从3’到5’端依次编码五个结构蛋白(核蛋白、磷酸蛋白、基质蛋白、糖蛋白和依赖RNA的RNA聚合酶)。糖蛋白是病毒粒子表面唯一的糖基化结构蛋白,与宿主细胞表面受体结合导致细胞膜融合促进病毒入侵细胞,也是诱导机体产生中和抗体的主要抗原。临床上80%的狂犬病患者检测不到中和抗体。研究表明实验室毒株刺激机体产生中和抗体,而野毒株不能,导致这种差异的机制尚未揭晓。有研究报道,实验室毒株激活的机体先天性免疫反应与病毒糖蛋白表达正相关,而野毒株狂犬病毒逃避机体先天免疫识别。先天性免疫反应不仅可以直接杀伤病毒还可以诱导机体产生特异性抗病毒免疫反应。树突状细胞是体内广泛分布的功能最强大的抗原递呈细胞,其在机体先天性和特异性免疫反应中起着重要作用。有研究表明狂犬病毒实验室毒株通过IPS-1通路激活树突状细胞,狂犬病毒先导RNA可以激活人肾细胞IPS-1信号通路。以上报道均是以实验室毒株狂犬病毒为研究对象。本实验旨在研究野毒株狂犬病毒通过树突状细胞逃避免疫识别的机制。以狂犬病毒在体外刺激的树突状细胞移植的嵌合体小鼠...

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摘要
Abstract
英文缩略语表(Abbreviation)
第1章 前言
    1.1. 狂犬病及其危害
    1.2. 狂犬病流行病学
    1.3. 狂犬病毒病原性特征
        1.3.1. 狂犬病毒的理化性质
        1.3.2. 狂犬病毒的结构
        1.3.3. 狂犬病毒分型
        1.3.4. 狂犬病毒基因组特点
        1.3.5. 狂犬病毒结构蛋白
    1.4. 狂犬病毒感染细胞过程
        1.4.1 狂犬病毒结构在感染过程中的作用
        1.4.2 狂犬病毒的细胞受体
        1.4.3 狂犬病毒潜在的细胞受体
        1.4.4 细胞内吞与狂犬病毒
        1.4.5 狂犬病毒穿透细胞膜
        1.4.6 狂犬病毒的细胞内转运
        1.4.7 狂犬病毒影响细胞功能促进感染
        1.4.8 病毒的核转移
    1.5. 细胞免疫与狂犬病毒感染
        1.5.1 模式识别受体与病毒感染
        1.5.2 C型凝集素受体与狂犬病毒
        1.5.3 干扰素信号通路与狂犬病毒
        1.5.4 细胞自噬与狂犬病毒
    1.6. 狂犬病毒与树突状细胞
        1.6.1 树突状细胞表面的病毒受体
        1.6.2 树突状细胞对T细胞的调节作用
        1.6.3 病毒与树突状细胞的相互作用
        1.6.4 树突状细胞在狂犬病免疫中的作用
第2章 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 毒株与细胞
        2.1.2 主要药品及试剂
        2.1.3 培养基
        2.1.4 实验动物
    2.2 方法
        2.2.1 表达野毒株磷酸化蛋白或野毒株糖蛋白重组狂犬病毒构建
        2.2.2 小鼠bmDCs的分离培养、纯化及鉴定
        2.2.3 小鼠bmDCs回输及攻毒保护性实验
        2.2.4 免疫电镜定量分析狂犬病毒表面糖蛋白含量
        2.2.5 Western Blotting检测病毒蛋白在细胞中的表达量
        2.2.6 相对荧光定量检测细胞因子的相对表达水平
        2.2.7 绝对荧光定量检测病毒vRNA、mRNA cRNA的转录水平
        2.2.8 绝对荧光定量检测病毒Leader RNA的转录水平
        2.2.9 共聚焦显微镜检测细胞融合
        2.2.10 脂质体荧光染色检测细胞融合
        2.2.11 细胞荧光转化灶单位(Fluorescence focus units,FFU)实验滴定狂犬病毒
        2.2.12 荧光抗体病毒中和试验方法检测狂犬病毒中和抗体
        2.2.13 抗原刺激树突状细胞及免疫保护试验
        2.2.14 流式细胞术检测体内和体外免疫细胞表性变化
        2.2.15 T7体外转录RNA和RNA去磷酸化
        2.2.16 RNA转染DCs
        2.2.17 糖蛋白亚病毒粒子体外分离
        2.2.18 体外转录翻译合成蛋白质
        2.2.19 免疫沉淀
第3章 结果与分析
    3.1 野毒株狂犬病毒逃避树突状细胞识别
        3.1.1 狂犬病毒滴定
        3.1.2 野毒株和实验室毒株狂犬病毒复制的差异
        3.1.3 狂犬病毒感染的树突状细胞后树突状细胞表型的变化
        3.1.4 狂犬病毒感染的树突状细胞的剂量依赖性检测
        3.1.5 狂犬病毒感染的树突状细胞对细胞因子分泌的改变
        3.1.6 狂犬病毒刺激的树突状细胞回输小鼠对免疫细胞分化的影响
        3.1.7 狂犬病毒刺激的树突状细胞回输小鼠的狂犬病毒中和抗体水平
        3.1.8 狂犬病毒刺激的树突状细胞回输小鼠的免疫保护实验
        3.1.9 狂犬病毒刺激的树突状细胞回输小鼠对小鼠的致死率
        3.1.10 狂犬病毒未抑制树突状细胞的激活
    3.2 野毒株糖蛋白降低狂犬病毒感染DCs
        3.2.1 抗体亲和力比较
        3.2.2 狂犬病毒野毒株糖蛋白降低病毒对DCs的吸附能力
        3.2.3 野毒株糖蛋白降低狂犬病毒对DCs入侵
        3.2.4 狂犬病毒野毒株糖蛋白降低了病毒与细胞膜的融合
        3.2.5 狂犬病毒吸附依赖DC表面蛋白受体
        3.2.6 狂犬病毒野毒株糖蛋白表达量低于实验室毒株
        3.2.7 野毒株病毒粒子表面糖蛋白少于弱毒株
    3.3 野毒株狂犬病毒抑制Leader RNA释放
        3.3.1 细胞内野毒株狂犬病毒LeaderRNA转录低于弱毒
        3.3.2 体外转录狂犬病毒Leader RNA 及Leader RNA二级结构分析
        3.3.3 狂犬病毒LeaderRNA转染激活DCs
        3.3.4 狂犬病毒依赖IPS-1信号通路激活树突状细胞
第4章 讨论
    4.1 狂犬病毒野毒株逃避宿主DCs的识别
        4.1.1 树突状细胞在野毒株狂犬病毒免疫逃避中起关键作用
        4.1.2 T细胞和B细胞在野毒株狂犬病毒免疫逃避中的作用
        4.1.3 野毒株狂犬病毒糖蛋白在免疫逃避中的作用
        4.1.4 狂犬病毒诱导的树突状细胞激活取决于糖蛋白依赖的病毒RNA转录
    4.2 野毒株狂犬病毒限制糖蛋白表达的机制
        4.2.1 狂犬病毒糖蛋白抗体亲和力比较
        4.2.2 野毒株与实验室毒株狂犬病毒糖蛋白序列比对分析
        4.2.3 野毒株狂犬病毒降低糖蛋白表达的三种假设
    4.3 以树突状细胞为载体的狂犬病细胞疫苗
结论
参考文献
附录
致谢



本文编号：4040366