VSV诱导N2a细胞凋亡的主导蛋白及其互作蛋白的鉴定

发布时间：2017-05-29 18:07

  本文关键词：VSV诱导N2a细胞凋亡的主导蛋白及其互作蛋白的鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)是弹状病毒科水疱病毒属的一员,主要引起猪、马、牛及一些野生动物发生水疱性口炎。VSV感染动物后,其特征性的临床症状为舌、唇、颊黏膜、乳头、蹄冠出现水疱,水疱易破裂,露出肉芽组织,呈红色糜烂。人接触该病毒后偶然发病,表现为流感样症状,出现短期发热、怕冷、头痛、恶心、肌肉痛、无力等症状。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的动物疫病。VSV除引起严重的口炎外,其对神经系统的损伤逐渐被研究人员所重视。与其它的嗜神经病毒相似,VSV感染后可以沿着轴突顺行或逆行传播,主要引起中枢神经的损伤。通过对小鼠脑部接种该病毒可快速引起神经细胞变性坏死及单核细胞浸润,而鼠脑部神经细胞损伤与凋亡密切相关。M蛋白是VSV的一种结构蛋白,作为一种重要的毒力因子,在VSV诱导疾病发生发展的过程中至关重要。对其它易感细胞的研究发现,其不仅诱导病毒的聚集过程,引起已感染VSV的细胞发生病变,而且参与VSV诱导细胞的凋亡过程和对宿主细胞的抗病毒免疫。但M蛋白在VSV侵嗜神经过程中的作用尚不清楚目前。为此,本论文开展了以下研究工作。VSV可在小鼠神经瘤母细胞(N2a细胞)上复制增殖且感染细胞出现明显的CPE。因此,本实验选择VSV感染的N2a细胞为感染模型,首先通过形态学的观察、PCR鉴定、Hochest染色、DNA Ladder及流式细胞术检测VSV感染N2a细胞的凋亡率。结果表明,VSV可以引起N2a细胞的凋亡。然后,分别构建VSV-M、VSV-G和VSV-P的真核表达载体,转染后检测细胞的凋亡情况,结果显示,转染VSV-M蛋白后细胞的凋亡率高于另外两者。由此可见,VSV-M蛋白是诱导N2a细胞凋亡的主导蛋白之一。以VSV-M作为诱饵,构建其诱饵表达载体,进行其互作蛋白的筛选鉴定。应用酵母双杂交技术将构建的VSV-M诱饵质粒转化至AH109酵母感受态细胞中,检测诱饵质粒对酵母细胞的毒性及自激活作用。检测结果表明可以进行后续实验,将诱饵质粒与鼠脑c DNA文库进行杂交融合,通过在营养缺陷型培养基上多次筛选后初步获得一些阳性克隆。提取阳性克隆的酵母质粒转化至大肠杆菌中,再提取质粒后,应用PCR技术进行鉴定,然后将阳性的质粒测序,测序结果与NCBI数据库进行比对分析后,初步确定一些与VSV-M蛋白相互作用的蛋白,如羧基肽酶-E、HAX-1。HAX-1(HS1-associated protein X-1,HS1相关蛋白X-1)是一种可以与丝氨酸/酪氨酸激酶的底物HS1(hematopoietic cell specific Lyn substrate1)相互作用的蛋白质,分子量为35 k Da,由HAX-1基因编码,可以与多种蛋白发生相互作用。HAX-1可能参与B细胞信号的转导、受体介导的凋亡及增殖反应等多种不同生物学作用。近年来对HAX-1的研究越来越多,但还未见在VSV感染方面的研究。为了验证所筛选的蛋白与VSV-M蛋白间可能存在相互作用,我们首先进行了酵母双杂交回转杂交试验,然后通过PCR技术获得HAX-1基因,构建其真核表达载体,同时构建VSV-M原核表达载体,以制备其多克隆抗体为后续实验所用。之后进行GST Pull-down及免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)实验,验证两者相互作用的特异性。将构建的VSV-M及HAX-1蛋白的真核表达载体共转染,利用激光共聚焦显微镜观察确定两者的共定位现象。VSV-M与HAX-1的相互作用为在分子水平上探索M蛋白新功能奠定一定的基础,并为进一步研究VSV的致病机制提供一定的帮助。综上所述,本研究证实VSV可诱导神经细胞凋亡,为深入解析VSV致神经损伤的分子机制补充更多的实验数据。
【关键词】：VSV-M 细胞凋亡 酵母双杂交 HAX-1
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩略词表11-13
• 第一篇 文献综述13-29
• 第一章 水疱性口炎病毒基质蛋白研究进展13-18
• 1.1 水疱性口炎病毒的分子特征13-14
• 1.2 水疱性口炎病毒基质蛋白的结构特性14-15
• 1.3 水疱性口炎病毒与细胞凋亡15-18
• 第二章 宿主蛋白HAX-1 的研究现状18-24
• 2.1 HAX-1 蛋白概述18-20
• 2.2 HAX-1 的生物学功能20-24
• 第三章 酵母双杂交技术研究进展24-29
• 3.1 酵母双杂交技术原理24-25
• 3.2 酵母双杂交的应用25-27
• 3.3 酵母双杂交的优缺点27-28
• 3.4 展望28-29
• 第二篇 研究内容29-70
• 第一章 VSV诱导神经细胞凋亡的病毒主导蛋白确证29-41
• 1.1 材料29-30
• 1.2 方法30-35
• 1.3 结果35-39
• 1.4 讨论39-40
• 1.5 小结40-41
• 第二章 水疱性口炎病毒M蛋白互作宿主蛋白的筛选41-55
• 2.1 材料41-42
• 2.2 方法42-48
• 2.3 结果48-53
• 2.4 讨论53-54
• 2.5 小结54-55
• 第三章 VSV-M蛋白和宿主蛋白HAX-1 相互作用的鉴定55-70
• 3.1 材料55-56
• 3.2 方法56-60
• 3.3 结果60-67
• 3.4 讨论67-69
• 3.5 小结69-70
• 结论70-71
• 参考文献71-81
• 导师简介81-82
• 作者简介及在攻读硕士期间发表的学术论文82-83
• 致谢83

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