产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR和α毒素抗体ELISA检测方法的建立及初步应用

发布时间：2017-06-02 19:23

  本文关键词：产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR和α毒素抗体ELISA检测方法的建立及初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：产气荚膜梭菌可引起人畜多种疾病,致病作用由毒素引起,主要致死毒素为α、β、ε和ι。根据产生这4种毒素的能力将本菌分为A、B、C、D和E 5个型。为了快速检测产气荚膜梭菌、分型以及疫苗免疫后α毒素抗体的评价,本研究分别建立了产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR检测方法和α毒素抗体ELISA检测方法,获得了以下结果:1.羊源产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR检测方法的建立设计α、β、ε和ι毒素基因特异性引物,优化试验条件,建立产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR方法。特异性试验表明,该方法对A型、B型、C型、D型和E型产气荚膜梭菌标准菌株均扩增出了相应的目的条带,而诺维梭菌、腐败梭菌和灭菌双蒸水均扩增不到任何条带;灵敏性试验表明,该方法对A型、B型、C型、D型和E型标准菌株基因组DNA最低检测量分别为9.0 pg、17.8 pg、12.2 pg、13.8 pg和18.5 pg;重复性试验表明该方法有很好的重复性。应用所建立的方法从21份羊临床病料中检测到9株A型和1株C型产气荚膜梭菌。本研究建立的多重PCR方法可以进行产气荚膜梭菌的快速检测及5种毒素型的鉴别。2.产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及纯化复性根据GenBank已公布的产气荚膜梭菌α毒素基因序列,设计成熟肽引物,PCR扩增后构建pET-28a-α重组质粒,鉴定后,转化BL21(DE3),经诱导优化,纯化和复性,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,成功克隆了产气荚膜梭菌α毒素成熟肽基因片段;IPTG诱导浓度对重组蛋白表达的影响不大,诱导7 h最佳;表达形式为包涵体;纯化复性的α毒素重组蛋白能与产气荚膜梭菌阳性血清特异性结合,反应原性良好。3.产气荚膜梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法的建立以α毒素重组蛋白为包被抗原,建立α毒素抗体间接ELISA检测方法。优化间接ELISA最佳反应条件为:抗原按5.0μg/mL稀释包被,血清按1∶50稀释和酶标二抗1∶5000稀释;37℃封闭1 h,抗原抗体孵育1 h,TMB显色30 min。间接ELISA方法的临界值为0.393,特异性为96.5%,敏感性为98%,批内C.V在2%~3%之间,批间C.V小于8%。用建立的间接ELISA方法对521份山羊血清样本的检测结果表明阳性率为92.7%。本试验成功建立了产气荚膜梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法,并初步应用。
【关键词】：产气荚膜梭菌 多重PCR α毒素 原核表达 间接ELISA
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 文献综述12-17
• 第一章 产气荚膜梭菌研究进展12-17
• 1.1 产气荚膜梭菌的定型方法12-13
• 1.2 产气荚膜梭菌α毒素13-17
• 1.2.1 生物学特性13
• 1.2.2 N末端和C末端的结构及功能13-14
• 1.2.3 基因定点突变14-15
• 1.2.4 基因克隆与表达15-17
• 试验研究17-38
• 第二章 羊源产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR检测方法的建立17-25
• 2.1 材料17
• 2.1.1 菌株17
• 2.1.2 主要试剂17
• 2.1.3 临床样品17
• 2.2 方法17-20
• 2.2.1 菌株培养与模板制备17
• 2.2.2 引物的设计与合成17-18
• 2.2.3 单项PCR检测方法的建立18-19
• 2.2.4 多重PCR条件优化19
• 2.2.5 特异性试验19
• 2.2.6 敏感性试验19-20
• 2.2.7 重复性试验20
• 2.2.8 临床样品检测20
• 2.3 结果20-23
• 2.3.1 单项PCR扩增结果20
• 2.3.2 多重PCR引物浓度的优化结果20-21
• 2.3.3 多重PCR退火温度优化结果21
• 2.3.4 特异性试验结果21-22
• 2.3.5 敏感性试验结果22
• 2.3.6 重复性试验结果22-23
• 2.3.7 多重PCR的临床应用23
• 2.4 讨论23-24
• 2.5 小结24-25
• 第三章 产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及纯化复性25-33
• 3.1 材料25
• 3.1.1 主要试剂25
• 3.1.2 阳性血清25
• 3.2 方法25-29
• 3.2.1 引物设计与合成25-26
• 3.2.2 α毒素成熟肽基因片段的扩增26
• 3.2.3 重组表达载体的构建26-27
• 3.2.4 α毒素重组蛋白诱导表达条件的优化27
• 3.3.5 α毒素重组蛋白表达形式的分析及纯化27-28
• 3.2.6 α毒素重组蛋白的复性28
• 3.2.7 α毒素重组蛋白的Western blot分析28-29
• 3.3 结果29-31
• 3.3.1 PCR扩增结果29
• 3.3.2 原核重组质粒的鉴定29
• 3.3.3 α毒素重组蛋白诱导表达条件的优化29-30
• 3.3.4 α毒素重组蛋白表达形式的分析及纯化30-31
• 3.3.5 重组蛋白的Western blot分析31
• 3.4 讨论31-32
• 3.5 小结32-33
• 第四章 产气荚膜梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法的建立33-38
• 4.1 材料33
• 4.1.1 主要试剂33
• 4.1.2 血清33
• 4.2 方法33-35
• 4.2.1 抗原、血清和酶标二抗工作浓度的确定33-34
• 4.2.2 其他试验条件的优化34
• 4.2.3 间接ELISA方法临界值的确定34
• 4.2.4 特异性试验34-35
• 4.2.5 敏感性试验35
• 4.2.6 批内、批间重复性试验35
• 4.2.7 临床样本检测35
• 4.3 结果35-36
• 4.3.1 抗原、血清和酶标二抗的最佳工作浓度35
• 4.3.2 其他试验条件的优化35
• 4.3.3 间接ELISA方法的临界值35-36
• 4.3.4 间接ELISA方法的特异性、敏感性和重复性36
• 4.3.5 临床样本检测36
• 4.4 讨论36-37
• 4.5 小结37-38
• 结论38-39
• 参考文献39-43
• 附录43-46
• 致谢46-48
• 作者简介48

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