猪MELK催化结构域的克隆表达及其与猪BCL-G共转染对细胞凋亡的影响

发布时间：2017-06-02 21:23

  本文关键词：猪MELK催化结构域的克隆表达及其与猪BCL-G共转染对细胞凋亡的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：母系胚胎亮氨酸拉链激酶(Maternal embryonic leucine zipper kinase,MELK),在鼠上叫做鼠源蛋白丝/苏氨酸激酶38(MPK38),在非洲爪蟾中也叫做pEg3,是细胞周期依赖蛋白激酶KIN1/PAR-1/MARK家族中的一个成员,在多种特异干细胞和癌细胞中高度表达。MELK广泛参与细胞的变化过程,其中包括细胞周期调控、细胞增殖、细胞凋亡、剪接体组装、基因表达、胚胎发育、造血作用和肿瘤形成等。在乳腺癌细胞中MELK可以直接磷酸化BCL-GL,抑制BCL-GL介导的细胞凋亡作用。本实验室已克隆出猪MELK(pMELK)和猪BCL-G(pBCL-G),并通过免疫共沉淀和流式细胞术实验证明了pMELK能与pBCL-G发生相互作用,而后抑制pBCL-G的促凋亡作用。为研究pMELK催化结构域是否会抑制pBCL-G的促凋亡作用,本研究运用真核表达载体构建和流式细胞术等技术,来探究过表达pMELK催化结构域(catalytic domain,cd)对细胞凋亡的影响。研究结果如下:1.为获得稳定表达pBCL-G基因的细胞株,本实验对存放超过两年的细胞株进行表达稳定性检测。结果表明,pBCL-G基因能够持续稳定表达,为后续基因功能的研究奠定基础。2.本实验将pMELK的催化结构域连接到pCMV-HA真核表达载体,构建重组载体pCMV-HA-MELK-cd。采用脂质体法转染至猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)。48 h后收集细胞进行裂解,western blot检测融合蛋白pCMV-HA-MELK-cd的表达情况。3.我们将pCMV-HA空载体(阴性对照组)、pCMV-HA-pMELK-cd(实验组)和pCMV-HA-pMELK(阳性对照组)载体转染至稳定表达GFP-pBCL-G的SUVEC细胞中,分别用500 nM的STS诱导18 h后收集细胞,并进行流式细胞术检测。结果发现pMELK的催化结构域不能抑制pBCL-G的促凋亡作用。
【关键词】：猪MELK基因 催化结构域 真核表达 细胞凋亡
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 文献综述9-14
• 第一章 MELK的研究进展9-14
• 1.1 MELK概述9
• 1.2 MELK在细胞凋亡中的作用9-12
• 1.2.1 MELK蛋白与BCL-G等多种蛋白发生相互作用9-11
• 1.2.2 MELK在癌症中发挥重要作用11-12
• 1.2.3 MELK可以调控细胞周期12
• 1.2.4 MELK参与胚胎发育12
• 1.3 MELK的研究前景12-13
• 1.4 MELK的研究意义13-14
• 试验研究14-31
• 第二章 表达猪BCL-G蛋白细胞株的稳定性检测14-17
• 2.1 材料14-15
• 2.1.1 细胞株和载体14
• 2.1.2 主要试剂14
• 2.1.3 主要仪器14-15
• 2.2 方法15-16
• 2.2.1 Western blot检测鉴定稳定表达细胞株15-16
• 2.2.2 Western blot检测稳定表达GFP-pBCL-G细胞株的稳定性16
• 2.3 结果16
• 2.4 讨论16
• 2.5 小结16-17
• 第三章 猪MELK催化结构域在SUVEC细胞中的表达17-26
• 3.1 材料17-18
• 3.1.1 细胞株和载体17
• 3.1.2 主要试剂17-18
• 3.1.3 主要仪器18
• 3.2 方法18-23
• 3.2.1 构建pMELK-cd真核表达载体18-22
• 3.2.2 质粒转染22-23
• 3.2.3 Western blot检测pMELK-cd蛋白23
• 3.3 结果23-24
• 3.3.1 重组质粒pCMV-HA-pMELK-cd双酶切鉴定和测序结果23
• 3.3.2 重组质粒浓度检测结果23-24
• 3.3.3 Western blot鉴定结果24
• 3.4 讨论24-25
• 3.5 小结25-26
• 第四章 猪MELK催化结构域蛋白对猪BCL-G蛋白介导细胞凋亡的研究26-31
• 4.1 材料26-27
• 4.1.1 细胞株和载体26
• 4.1.2 主要试剂26-27
• 4.1.3 主要仪器27
• 4.2 方法27-28
• 4.2.1 细胞转染27
• 4.2.2 HA-pMELK、HA-pMELK-cd融合蛋白在真核细胞中的表达27
• 4.2.3 STS诱导共表达pBCL-G和pCMV-HA、p MELK-cd、pMELK的细胞27
• 4.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率27-28
• 4.3 结果28-30
• 4.3.1 质粒浓度检测结果28
• 4.3.2 Western blot鉴定结果28-29
• 4.3.3 STS诱导的过表达pMELK-cd和pBCL-G蛋白的细胞凋亡率检测29-30
• 4.4 讨论30
• 4.5 小结30-31
• 结论31-32
• 参考文献32-35
• 缩略词35-37
• 试剂配方37-40
• 致谢40-42
• 作者简介42

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