H9N2AIV对肉鸡肠道菌群和肠道组织紧密连接的影响

发布时间：2017-06-08 09:08

  本文关键词：H9N2AIV对肉鸡肠道菌群和肠道组织紧密连接的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)是一种低致病性禽流感病毒,其临床症状表现温和,易继发细菌感染和支原体感染,对我国畜牧业造成严重的经济损失。H9N2AIV感染肉鸡引起机体免疫抑制,继发感染细菌时常伴发胃肠道炎症,但H9N2 AIV感染后对肉鸡肠道菌群的影响仍未可知。本研究通过Illumina Hiseq 2000测序技术和实时荧光定量PCR(qPCR)的方法研究H9N2 AIV感染后肉鸡肠道菌群结构及其肠道粘膜组织紧密连接的变化,为H9N2 AIV继发感染的防控提供理论指导,为进一步研发抗流感病毒的微生态制剂提供理论依据。本研究对1株于2015年1月在河南某鸡场分离到的H9N2 AIV(毒株HN/SH01/15)进行纯化,并测定分离株的毒价为106.13 EID50/0.1mL;通过系统发育树分析表明该分离株属于H9.4.2.1亚分支,其与国内疫苗毒株SH/F/98株之间的同源性达到89.4%,与GD/SS/94株之间的同源性是90.4%,与SD/6/96株之间的同源性是89.8%。本研究利用Illumina Hiseq 2000测序平台对感染SH01毒株的鸡的回肠粘膜和盲肠粘膜菌群基因组DNA进行16S rDNA宏基因组测序,以分析H9N2 AIV对肉鸡肠道菌群的影响。测序结果表明:1)回肠菌群序列深度基本覆盖样品中所有的物种,满足试验分析需要;2)攻毒组均含特异Operational Taxonomic Unit(OTU);3)感染H9N2 AIV后肉鸡肠道菌群组成和各菌属相对丰度发生了变化,且盲肠粘膜上缺少考拉杆菌属,出现Sutterella。本研究用qPCR方法对感染H9N2 AIV后肉鸡回肠和盲肠粘膜埃希氏菌属含菌量进行检测,进一步验证16S rDNA宏基因组测序的结果。结果表明,与空白组相比,攻毒后第5天攻毒组埃希氏菌属在回肠粘膜上增加(p0.05),在盲肠粘膜上增加;攻毒后第12天埃希氏菌属在回肠粘膜上减少(p0.01),在盲肠粘膜上减少。其变化的趋势与Illumina宏基因组测序结果一致。本研究用相对荧光定量PCR对感染H9N2 AIV后肉鸡回肠和盲肠粘膜紧密连接进行探究。结果表明:攻毒后第5天,回肠绒毛长度显著降低(p0.05);盲肠粘膜结构蛋白ZO-1和Occludin极显著下调(p0.01)。攻毒后第12天,回肠隐窝显著降低(p0.05),绒毛长度/隐窝深度显著减少(p0.05),Occludin mRNA表达量显著下调(p0.05);盲肠粘膜上Occludin mRNA表达量下调极显著(p0.01)。H9N2 AIV感染鸡后,降低了粘膜组织紧密连接,能够增加肠道粘膜组织通透性。本研究表明H9N2 AIV感染能够造成肠道菌群紊乱,感染后肠道粘膜组织紧密连接降低,增加了宿主继发感染的机会。
【关键词】：H9N2 AIV 肠道菌群 Illumina Hiseq 2000测序平台 qPCR 紧密连接
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 中英文缩略表7-11
• 1 前言11-18
• 1.1 禽流感病毒简介11-12
• 1.1.1 禽流感病毒的结构与分类11
• 1.1.2 H9N2 AIV的共感染11-12
• 1.2 肠道微生物菌群的研究12-17
• 1.2.1 肠道微生物菌群与宿主健康息息相关。12-14
• 1.2.1.1 肠道微生物与宿主的肠道生理结构和功能12-13
• 1.2.1.2 肠道微生物与宿主的物质代谢13
• 1.2.1.3 肠道微生物与宿主免疫调节13-14
• 1.2.1.4 肠道微生物与宿主的异物代谢14
• 1.2.2 肠道微生物菌群与宿主疾病的研究14-16
• 1.2.2.1 肠道微生物与全身代谢疾病14-15
• 1.2.2.2 肠道微生物与肠易激综合征15-16
• 1.2.3 宏基因组高通量测序的研究与应用16-17
• 1.3 研究目的和意义17-18
• 2 试验材料与方法18-27
• 2.1 试验材料18-21
• 2.1.1 毒株18
• 2.1.2 SPF鸡胚和SPF鸡18
• 2.1.3 引物18-20
• 2.1.3.1 测序引物18-19
• 2.1.3.2 荧光定量引物19-20
• 2.1.4 菌种与质粒20
• 2.1.5 标准阳性血清与抗原20
• 2.1.6 主要试剂及配制20-21
• 2.1.7 酶及其他试剂、试剂盒21
• 2.1.8 主要仪器设备21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 H9N2 AIV的纯化与HA基因序列分析21-24
• 2.2.1.1 病毒的纯化及保存21-22
• 2.2.1.2 病毒EID50的测定22
• 2.2.1.3 H9N2 AIV HA基因的克隆、测序及分析22-24
• 2.2.2 动物实验24-25
• 2.2.2.1 动物饲养、攻毒24
• 2.2.2.2 样品采集24-25
• 2.2.2.3 排毒检测25
• 2.2.2.4 样品处理25
• 2.2.3 Illumina宏基因组测序25-26
• 2.2.4 绝对荧光定量PCR26-27
• 2.2.4.1 标准质粒的构建26
• 2.2.4.2 标准曲线的构建26-27
• 2.2.4.3 绝对荧光定量PCR反应27
• 2.2.5 相对荧光定量PCR27
• 2.2.6 数据分析27
• 3 结果与分析27-50
• 3.1 H9N2 AIV病毒毒价的测定与HA基因序列分析27-30
• 3.1.1 H9N2 AIV病毒毒价的测定结果27
• 3.1.2 HA基因遗传进化分析27-28
• 3.1.3 HA基因同源性分析28-30
• 3.2 排毒检测30
• 3.3 H9N2 AIV对肉鸡肠道菌群影响的宏基因组测序分析30-47
• 3.3.1 回肠粘膜菌群序列样品深度分析30
• 3.3.2 回肠粘膜菌群OTU Venn图的分析30-32
• 3.3.3 回肠粘膜菌群物种及其丰度分析32-39
• 3.3.3.1 回肠粘膜菌群物种多样性指数分析32-33
• 3.3.3.2 回肠粘膜菌群物种结构组成变化分析33-37
• 3.3.3.3 H9N2 AIV对鸡回肠粘膜菌群结构的影响37-39
• 3.3.4 盲肠粘膜中菌群OTU及其丰度分析39-41
• 3.3.4.1 盲肠粘膜菌群序列样品深度分析39
• 3.3.4.2 盲肠粘膜菌群OTU Venn图的分析39-41
• 3.3.5 盲肠粘膜菌群物种及其丰度分析41-47
• 3.3.5.1 盲肠粘膜菌群物种多样性指数分析41-42
• 3.3.5.2 盲肠粘膜群落结构变化42-45
• 3.3.5.3 H9N2 AIV对鸡盲肠粘膜菌群物种结构的影响45-47
• 3.4 qPCR检测肠道内埃希氏菌属的变化47-48
• 3.5 H9N2 AIV对肉鸡肠道紧密连接的影响48-50
• 3.5.1 回肠形态结构HE染色结果48-49
• 3.5.2 肠道粘膜结构蛋白mRNA的表达量变化49-50
• 4 讨论50-56
• 4.1 H9N2 AIV流行情况50-51
• 4.2 感染H9N2 AIV的肉鸡肠道菌群的宏基因组测序分析51-54
• 4.3 H9N2 AIV对肉鸡肠道紧密连接功能的影响54-55
• 4.4 结论55-56
• 致谢56-57
• 参考文献57-64

【参考文献】

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本文编号：432024