布鲁氏菌胞内生存相关sRNA的筛选及非编码小RNA BSR0441功能的初步研究

发布时间：2017-06-10 04:09

  本文关键词：布鲁氏菌胞内生存相关sRNA的筛选及非编码小RNA BSR0441功能的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌感染引起的一种危害严重的人兽共患传染病。在世界各地广泛流行,给人类健康和畜牧业发展带来严重危害。动物感染后出现流产或不育,对畜牧业带来巨大损失；人感染主要由于食用或接触了患病动物或畜产品污染所致,感染后表现为关节炎,心内膜炎和脑膜炎等。布鲁氏菌为革兰氏阴性菌、胞内寄生菌,主要寄生于单核细胞(常为巨噬细胞)内,在细胞内生存和复制是其主要毒力特征。细菌非编码小RNA (small non-coding RNA, sRNA)是近年来在细菌中发现的一类RNA调控子,它们在应对环境变化的基因表达调控中扮演重要角色,是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调控子。作用方式主要是通过碱基互补配对与靶标基因mRNA结合,影响mRNA的稳定性和翻译,进而在转录水平上调控基因表达。本研究中,我们通过单链特异性深度测序筛选了布鲁氏菌中的大量sRNA。选取30个与胞内生存相关的sRNA进行验证,并利用RT-PCR验证体外模拟细胞内环境刺激条件它们的转录情况。对其中一个涉及布鲁氏菌毒力相关的sRNA即BSR0441进行研究,并对BSR0441的靶基因进行了预测和验证,分析了BSR0441在布鲁氏菌胞内生存中的作用。首先,标准培养条件下体外培养布鲁氏菌16M株,提取总RNA，纯化mRNA后利用dUTP第二链标记方法制备cDNA文库,PCR扩增后进行单链特异性测序,以16M基因组序列为参照对测序得到的reads进行比对,分析鉴定所有的sRNA。结果表明,reads在基因组上的覆盖度良好,总共识别了1321个sRNA,长度在100到600 nt间。这些sRNA在布鲁氏菌染色体中的分布不同,同时它们的转录水平也存在差异。RT-PCR结果显示,预测的sRNA在体外条件下都存在转录,且与布鲁氏菌胞内生存相关。运用TargetRNA2预测sRNA的靶基因,BSR0441的靶基因主要为布鲁氏菌毒力相关的转录调控因子。为了验证测序结果的正确性,首先利用Northern blot确认BSR0441在布鲁氏菌中存在转录。qRT-PCR分析BSR0441在布鲁氏菌体外不同生长期及感染情况下的转录,结果显示其在布鲁氏菌不同生长期和小鼠感染期间都存在转录。为进一步探讨BSR0441在布鲁氏菌胞内生存和毒力中的作用,构建了BSR0441的突变株(16M-△BSR0441)和过表达株(16M-BSR0441)，并对野生株(16M)、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的相关表型进行研究。生长曲线结果表明,BSR0441对布鲁氏菌的生长速度影响较小。在模拟巨噬细胞内环境的多种体外刺激条件下的生存能力结果表明,BSR0441缺失或过表达后在各种刺激条件的存活率降低、抵抗压力的能力下降,尤其在热应激和酸刺激下胞内存活率明显下降。巨噬细胞侵染试验结果表明,BSR0441缺失与过表达使布鲁氏菌在细胞感染期间的存活能力下降。小鼠毒力试验结果显示,感染中后期突变株的数量较野生株明显减少,表明BSR0441参与调控布鲁氏菌在体内的生存和繁殖。为进一步了解BSR0441在布鲁氏菌中的作用,我们对其靶基因进行了预测,并采用qRT-PCR分析16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441对5个靶基因的转录水平的影响。结果表明,在巨噬细胞和小鼠感染期间BSR0441的缺失与过表达影响了其靶基因的转录,且该sRNA同时调控多个靶基因。
【关键词】：布鲁氏菌 sRNA 单链特异性深度测序 毒力 胞内生存
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略词表8-12
• 第一章 文献综述12-22
• 1 布鲁氏菌病的危害及其病原学特征12-13
• 2 布鲁氏菌的致病机理13-15
• 3 细菌sRNA的分类和功能15-17
• 4 细菌sRNA的筛选、鉴定及靶基因的预测17-20
• 4.1 细菌sRNA的筛选与鉴定方法17-19
• 4.2 sRNA靶基因的生物信息学预测19-20
• 5 布鲁氏菌sRNA的研究现状20-21
• 6 本研究的目的意义21-22
• 第二章 布鲁氏菌胞内生存相关sRNA的筛选22-36
• 1 材料22-24
• 1.1 菌株及培养基22-23
• 1.2 主要试剂23
• 1.3 试验仪器23
• 1.4 引物23-24
• 2 方法24-27
• 2.1 布鲁氏菌sRNA的筛选24-25
• 2.2 不同刺激条件下布鲁氏菌sRNA的RT-PCR鉴定25-26
• 2.2.1 提取不同体外刺激条件下16M总RNA25-26
• 2.2.2 Dnase Ⅰ处理26
• 2.2.3 cDNA第一链的合成26
• 2.2.4 RT-PCR鉴定26
• 2.3 布鲁氏菌sRNA靶基因的预测26-27
• 3 结果与分析27-33
• 3.1 布鲁氏菌sRNA的筛选27-29
• 3.1.1 16M转录组的测序数据分析27-28
• 3.1.2 候选sRNA的特征28-29
• 3.2 体外刺激条件下16M sRNA的RT-PCR鉴定29-31
• 3.3 布鲁氏菌sRNA(Candidate_1069)靶基因的预测31-33
• 4 讨论33-36
• 4.1 布鲁氏菌sRNA的筛选33-35
• 4.2 布鲁氏菌sRNA的RT-PCR验证35
• 4.3 布鲁氏菌sRNA(Candidae_1069)靶基因的预测35-36
• 第三章 布鲁氏菌非编码小RNA BSR0441功能的初步研究36-60
• 1 材料36-39
• 1.1 菌株、细胞系、载体及培养基36
• 1.2 试验动物36-37
• 1.3 主要试剂37
• 1.4 试验仪器37-38
• 1.5 引物38-39
• 2 方法39-45
• 2.1 BSR0441的Northern Blot验证39-40
• 2.1.1 DIG-BSR0441探针的制备39
• 2.1.2 Northern Blot验证39-40
• 2.2 BSR0441在体外以及体内的转录分析40-41
• 2.2.1 BSR0441在体外不同生长时期的转录40
• 2.2.2 BSR0441在细胞内的转录40-41
• 2.2.3 BSR0441在小鼠体内的转录41
• 2.3 BSR0441突变株和过表达株的构建41-44
• 2.3.1 BSR0441突变株的构建41-43
• 2.3.2 BSR0441过表达株的构建43
• 2.3.3 BSR0441突变株和过表达株的RT-PCR验证43-44
• 2.4 BSR0441突变株和过表达株的表型分析44-45
• 2.4.1 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的生长曲线测定44
• 2.4.2 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的体外应激试验44
• 2.4.3 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的细胞侵染试验44
• 2.4.4 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的小鼠毒力试验44-45
• 2.5 BSR0441重要靶基因的qRT-PCR分析45
• 2.5.1 细胞内靶标基因的qRT-PCR45
• 2.5.2 小鼠体内靶标基因的qRT-PCR45
• 3 结果与分析45-56
• 3.1 BSR0441的Northern Blot验证45-46
• 3.2 BSR0441的转录分析46-48
• 3.2.1 BSR0441在体外不同生长时期的转录46
• 3.2.2 BSR0441在细胞内的转录46-47
• 3.2.3 BSR0441在小鼠体内的转录47-48
• 3.3 BSR0441突变株和过表达株的构建48-51
• 3.3.1 BSR0441突变株的构建与鉴定48-49
• 3.3.2 BSR0441过表达株的构建与鉴定49-50
• 3.3.3 BSR0441突变株和过表达株的RT-PCR验证50-51
• 3.4 BSR0441突变株和过表达株的表型分析51-53
• 3.4.1 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的生长曲线51
• 3.4.2 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的体外应激试验51-52
• 3.4.3 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的细胞侵染试验52-53
• 3.4.4 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的小鼠毒力试验53
• 3.5 BSR0441重要靶基因的qRT-PCR分析53-56
• 3.5.1 感染细胞期间BSR0441对靶标基因的作用54-55
• 3.5.2 体内感染情况下BSR0441对靶标基因的作用55-56
• 4 讨论56-60
• 4.1 BSR0441的验证56-57
• 4.2 BSR0441突变株和过表达株的构建57-58
• 4.3 BSR0441相关毒力表型分析58
• 4.4 BSR0441对其靶基因的调控作用58-60
• 结论60-61
• 参考文献61-69
• 致谢69-70
• 攻读学位期间发表的学术论文70-71

【参考文献】

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本文编号：437380