鸭疫里默氏菌CH-1株wzxC基因功能研究

发布时间：2017-06-21 17:00

  本文关键词：鸭疫里默氏菌CH-1株wzxC基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)病是危害养鸭业的主要传染病之一,主要侵害2-7周龄的雏鸭,发病率和死亡率可达75%。临床上主要表现为困倦、下痢、共济失调,呈现典型的纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎。多糖(Polysaccharide,PS)属于细菌的重要组成部分,其中荚膜多糖(Capsular Polysaccharide,CPS)对细菌抵抗外界环境压力和毒力具有重要作用,但其在鸭疫里默氏菌中的合成途径我们并不清楚。Wzx是参与CPS的合成的寡聚糖翻转酶,同时还参与了脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的合成,但两种合成途径有所差别。生物信息分析表明鸭疫里默氏菌B739-1128基因编码的蛋白WzxC可能参与荚膜多糖的合成,为近一步验证这项推测,我们进行了以下研究。首先,我们利用自杀性质粒pYA4278和同源重组技术构建了RA-CH-1 ΔwzxC缺失株,并利用RT-PCR和荧光定量PCR检测突变株中wzxC下游基因B739-]129和wzxL基因,表明wzxC基因缺失不会引起B739-1129基因和wzxL基因的表达量发生变化。随后,对亲本株和缺失株进行了生物学特性比较分析,包括表型特点、荚膜染色、生化特性、生长曲线,发现wzxC基因缺失后会引起细菌的荚膜减少,生长稳定期菌量降低；故随后对菌株进行了耐药性、耐干燥性、耐氧化性、血清耐受性的检测,以及对SPF鸡胚的毒力和对Vero细胞的黏附入侵能力检测,结果表明,wzxC基因缺失后,细菌的耐干燥性下降了、耐氧化性、耐血清杀菌能力下降明显,对SPF鸡胚的ELDso下降4.38个数量级,而黏附入侵能力分别上调3.05个数量级和2.26个数量级,初步表明wzxC参与了CPS的合成,且CPS对RA的黏附入侵能力中起抑制作用。最后,分别提取了RA-CH-1亲本株RA-CH-1 ΔwzxC缺失株的CPS和LPS,并进行SDS-PAGE和银染,浓硫酸-苯酚法测定CPS提取物中多糖的含量,结果发现wzxC缺失后,LPS变化不明显,而CPS则含量降低21.23%,且其中中、长链CPS条带消失,表明wzxC与CPS合成相关,而与LPS合成相关性不明显。总之,本次实验从生物信息学分析的角度上和实验性方法上证明了鸭疫里默氏菌B739-1128编码的WzxC蛋白参与了荚膜多糖的合成,这为研究鸭疫里默氏菌荚膜多糖和脂多糖的功能和合成途径奠定了新的基础,也为研究Wzx蛋白的功能及其功能特异性积累了素材。同时本次实验成功构建了RA-CH-1ΔwzxC这株毒力明显下降但仍能保持甚至提高其黏附入侵能力的缺失株,为研究鸭疫里默氏菌减毒疫苗株提供了思路和方向。
【关键词】：鸭疫里默氏菌 荚膜多糖 Wzx 毒力 耐受性
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 缩略词表10-12
• 1 文献综述12-21
• 1.1 鸭疫里默氏菌研究进展12-13
• 1.1.1 病原学12
• 1.1.2 血清学12
• 1.1.3 毒力因子12-13
• 1.1.4 耐药性13
• 1.2 细菌多糖的研究进展13-17
• 1.2.1 荚膜多糖14
• 1.2.2 脂多糖14-15
• 1.2.3 多糖合成途径15-17
• 1.3 Wzx蛋白的研究进展17-21
• 1.3.1 Wzx蛋白家族17
• 1.3.2 Wzx作为翻转酶的功能确定17-18
• 1.3.3 Wzx蛋白结构18-19
• 1.3.4 Wzx蛋白的作用机制19-20
• 1.3.5 Wzx翻转酶的功能特异性分析20-21
• 2 研究目的与意义21-22
• 3 材料方法22-37
• 3.1 材料22-26
• 3.1.1 菌株、质粒和试验动物22
• 3.1.2 试剂22-23
• 3.1.3 仪器23
• 3.1.4 主要溶液的配制23-24
• 3.1.5 PCR引物设计24-25
• 3.1.6 生物信息学分析使用软件25-26
• 3.2 试验方法26-37
• 3.2.1 重组自杀性质粒的构建26-27
• 3.2.2 RA-CH-1 △wzxC缺失株的构建27-28
• 3.2.3 RA-CH-1 △wzxC缺失株中B739-1129和wzxL基因的表达检测28-30
• 3.2.4 RA-CH-1 △wzxC缺失株的表型特征研究30-31
• 3.2.5 RA-CH-1 △wzxC缺失株的耐受性分析31-33
• 3.2.6 RA-CH-1 △wzxC缺失株的毒力分析33-34
• 3.2.7 RA-CH-1 △wzxC缺失株中多糖生物学特性检测34-37
• 4 实验结果37-57
• 4.1 生物信息学分析37-39
• 4.1.1 RA-CH-1中wzxC基因特征分析37-38
• 4.1.2 RA-CH-1中WzxC蛋白特征分析38-39
• 4.2 RA-CH-1 △WZXC缺失株的构建39-43
• 4.2.1 重叠片段(L、S、R)的扩增39-40
• 4.2.2 重组自杀性质粒的构建40-42
• 4.2.3 RA-CH-1 △wzxC缺失株的鉴定42-43
• 4.3 RA-CH-1 △WZXC基因缺失株中B739-1129和WZXL基因的表达检测43-47
• 4.3.1 标准曲线的制备43-44
• 4.3.2 总RNA的提取和反转录44-45
• 4.3.3 RA-CH-1 △wzxC基因缺失株中B739-1129的表达检测45-46
• 4.3.4 RA-CH-1 △wzxC基因缺失株中wzxL表达检测46-47
• 4.4 RA-CH-1 △WZXC缺失株表型研究结果47-50
• 4.4.1 遗传稳定性检测47
• 4.4.2 表型研究47
• 4.4.3 荚膜染色47-48
• 4.4.4 生化特性48-49
• 4.4.5 对生长的影响49-50
• 4.5 RA-CH-1 △WZXC缺失株的耐受性分析结果50-53
• 4.5.1 耐药性分析50-51
• 4.5.2 耐干燥分析51
• 4.5.3 耐氧化性51-52
• 4.5.4 血清存活试验52-53
• 4.6 RA-CH-1 △WZXC缺失株的毒力分析结果53-54
• 4.6.1 SPF鸡胚ELD_(50)53-54
• 4.6.3 细胞的黏附与入侵实验54
• 4.7 RA-CH-1 △WZXC缺失株中多糖生物学特性检测54-57
• 4.7.1 凝集实验54-55
• 4.7.3 脂多糖的粗提取及银染鉴定55
• 4.7.4 荚膜多糖的粗提取及银染鉴定55-56
• 4.7.5 多糖含量的粗测定56-57
• 5 讨论57-62
• 5.1 鸭疫里默氏菌B739-1128的生物学信息分析57-59
• 5.3 WZXC基因与RA-CH-1株耐受性关系59-60
• 5.4 WZXC基因是RA-CH-1重要的毒力基因60-61
• 5.5 WZXC基因参与了荚膜多糖的合成61-62
• 6 结论62-63
• 参考文献63-71
• 致谢71-72
• 文章发表情况72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 马鹏;胡晓清;陈久洲;王小元;;大肠杆菌细胞外膜渗透性与脂多糖结构的关系(英文)[J];微生物学通报;2011年08期

2 陈蕾蕾;王未名;祝清俊;杜方岭;;细菌多糖的生物合成机制[J];微生物学报;2010年12期

3 仲崇岳;程安春;汪铭书;朱德康;张淑华;罗启慧;陈孝跃;;介导鸭疫里默氏杆菌耐β-内酰胺类药物发生的研究[J];中国兽医科学;2009年12期

4 程安春,汪铭书,陈孝跃,朱德康,黄城,刘菲,周毅,郭宇飞,刘兆宇,方鹏飞;我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现和病原特性[J];中国兽医学报;2003年04期

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