化脓隐秘杆菌溶血素单克隆抗体在解析其结构中的应用

发布时间：2017-06-24 20:13

  本文关键词：化脓隐秘杆菌溶血素单克隆抗体在解析其结构中的应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种常在菌,通常寄生于动物的皮肤粘膜、口咽、上呼吸道泌尿生殖和胃肠道。T.pyogenes同时也是一种人和动物(特别是牛、羊和猪等重要经济动物)的条件致病菌。T.pyogenes感染给养殖业造成的经济损失较大,染病牲畜通常表现化脓性感染。溶血素(Pyolysin,PLO)是化脓隐秘杆菌分泌的一种外毒素,并且是其唯一的溶血素,属于胆固醇依赖性溶细胞素家族(CDCs)。用重组PLO通过肌肉注射途径接种小鼠可引起注射部位局部化脓,说明PLO是化脓隐秘杆菌引起化脓性感染过程中的主要毒力因子。本研究首先制备了两株针对PLO的单克隆抗体,其中AP-4F12可以显著抑制PLO溶血活性,而AP-1A3并没有发现具有抑制溶血的活性。采用western-blot方法对这两株单抗所针对的抗原关键区域分析结果表明,AP-1A3所针对的抗原关键区域是PLO的第64位到79位氨基酸(包括信号肽在内为第91位至106位氨基酸),即V P V T K D Q L K D G T Y T V F,而AP-4F12所针对的抗原关键区域是PLO的第58位到75位氨基酸(包括信号肽在内为第85位到102位氨基酸),即G E S I E N V P V T K D Q L K D G T。结果表明PLO第58至63位氨基酸可能对PLO分子发挥溶血活性非常重要。随后,本研究利用定点突变法制备了六个PLO突变体,将第58至63位氨基酸分别用丙氨酸替代并检测每一个突变体蛋白的溶血活性。结果表明,PLO的第58-62位氨基酸(包括信号肽在内为85到89位氨基酸),即58位甘氨酸(G58)、59位谷氨酸(E59)、60位丝氨酸(S60)、61位异亮氨酸(I61)以及62位谷氨酸(E62)的突变能够影响PLO的溶血活性,其中第61位异亮氨酸对维持PLO的溶血活性是非常重要的。综上所述,本研究通过对制备的两株单克隆抗体所针对的抗原关键区域中的氨基酸残基在PLO发挥生物学效应过程中的作用进行了探讨,为阐明PLO分子结构与其成孔活性之间的关系提供部分数据依据。
【关键词】：溶血素 单克隆抗体 抗原关键区域 溶血活性 第61位异亮氨酸
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-21
• 1.1 化脓隐秘杆菌感染11
• 1.2 化脓隐秘杆菌11-12
• 1.2.1 化脓隐秘杆菌生物学特性11-12
• 1.2.2 化脓隐秘杆菌主要毒力因子12
• 1.3 溶血素12-15
• 1.3.1 PLO在化脓隐秘杆菌感染中的重要性13
• 1.3.2 PLO的基因和产生机制13-15
• 1.4 胆固醇依赖性的溶细胞素与溶血素15-17
• 1.4.1 Cholesterol-Dependent Cytolysins15
• 1.4.2 PLO与CDCs15-17
• 1.5 CDC成孔毒素的成孔机制17-20
• 1.5.1 CDC分子结构17-18
• 1.5.2 CDC的成孔机制简述18-20
• 1.6 研究的目的和意义20-21
• 2 材料与方法21-35
• 2.1 材料21-27
• 2.1.1 试验动物、细胞21
• 2.1.2 菌种与质粒21
• 2.1.3 引物设计与合成21-22
• 2.1.4 Oligo片段合成22-23
• 2.1.5 点突变引物设计23-24
• 2.1.6 主要试剂及抗体24-25
• 2.1.7 主要溶液的配制25-26
• 2.1.8 主要仪器26-27
• 2.2 方法27-35
• 2.2.1 重组蛋白的诱导表达27
• 2.2.2 抗化脓隐秘杆菌溶血素单克隆抗体的制备27-29
• 2.2.3 抗化脓隐秘杆菌溶血素单克隆抗体的鉴定29-30
• 2.2.4 溶血素溶血活性及其单抗的抗溶血活性30-31
• 2.2.5 单抗所针对抗原关键区域的鉴定31-33
• 2.2.6 溶血素PLO第 58-63位氨基酸对其溶血活性的影响33-35
• 3 结果与分析35-54
• 3.1 重组化脓隐秘杆菌溶血素制备35-37
• 3.1.1 rPLO的原核表达35
• 3.1.2 重组蛋白的Western-blot鉴定35-36
• 3.1.3 重组蛋白的纯化36-37
• 3.2 抗化脓隐秘杆菌溶血素单克隆抗体的制备及鉴定37-43
• 3.2.1 抗化脓隐秘杆菌溶血素单克隆抗体的制备37-38
• 3.2.2 抗化脓隐秘杆菌溶血素单克隆抗体的鉴定38-43
• 3.3 溶血素溶血活性及其单抗的抗溶血活性43-45
• 3.3.1 重组蛋白rPLO的溶血活性测定43
• 3.3.2 天然PLO的溶血活性测定43-44
• 3.3.3 单抗抗溶血活性测定44-45
• 3.4 单抗所针对抗原关键区域的鉴定45-49
• 3.4.1 分段蛋白的表达与鉴定45-48
• 3.4.2 单抗所针对抗原关键区域分析48-49
• 3.5 溶血素PLO第 58-63位氨基酸对其溶血功能影响的分析49-54
• 3.5.1 PLO突变体蛋白的制备和鉴定49-51
• 3.5.2 PLO突变体蛋白的Western-blot分析51-52
• 3.5.3 PLO突变体蛋白溶血活性的测定52-53
• 3.5.4 突变体rPLO-I61A与细胞膜结合的检测53-54
• 4 讨论54-57
• 4.1 抗溶血素蛋白单克隆抗体的制备及分析54
• 4.2 表位关键区域的筛选54-56
• 4.3 丙氨酸扫描分析PLO分子G58-E63对PLO溶血活性的作用56-57
• 5 结论57-58
• 致谢58-59
• 参考文献59-65
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文65

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本文编号：479368