江苏地区奶牛乳房炎葡萄球菌的分离鉴定与耐药模式分析

发布时间：2017-06-27 07:15

  本文关键词：江苏地区奶牛乳房炎葡萄球菌的分离鉴定与耐药模式分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛最常发生的疾病之一,它对牛场造成巨大的经济负担,对公共健康而言也是潜在的危机。病原菌感染是奶牛乳房炎最主要的病因。本研究采用传统方法从乳房炎奶样中进行病原菌分离、纯化,并从分离菌株药物敏感性和耐药基因两方面用生物统计学进行分析,总结主要分离菌——葡萄球菌的耐药模式,而后进一步对其中部分耐药基因失效的原因进行探究。主要内容如下：一、江苏地区奶牛乳房炎的流行病原调查以及葡萄球菌的分离纯化本研究在江苏地区采集了2012年3月至2014年3月的CMT检测阳性的630份奶样,其中有544个奶样检出细菌,利用传统的分离方法分离出825株,其中葡萄球菌393株,其检出率为47.63%；链球菌237株,其检出率为28.73%；杆菌190株,其检出率为23.03%；另有5株左氏无绿藻,其检出率为0.6%,进行药敏试验结果显示只有庆大霉素对左氏无绿藻有较好的抑制效果。二、乳房炎葡萄球菌的耐药模式探究针对其中主要的分离菌葡萄球菌,根据其表型耐药能力和耐药基因上分析耐药模式。根据CLSI的建议,使用纸片扩散法检测了其对15种不同抗生素的表型耐药能力,并用PCR检测了其中tetK、tetM、tetL、tetO、ermC、blaZ的分离率。本试验中84.73%的葡萄球菌对青霉素耐药,为耐药性最强的抗菌药物,其余依次为头孢他啶(47.58%)、诺氟沙星(36.13%)；而敏感性最好的抗菌药物是氯霉素(86.2%),其他依次是呋喃妥因(84.98%)、克拉霉素(79.39%)。在多重耐药上看,CNS的耐药性较多集中在双重抗性上,而SA在四重耐药是最集中的。而后根据卡方分析该地区葡萄球菌总体上的表型的耐药模式,发现针对干扰核酸代谢的药物,SA的耐药能力显著强于CNS；针对影响蛋白合成的抗生素,CNS的耐药性显著强于SA。这是目前耐药性研究中首次利用卡方检验从药物原理方向上去总结其耐药性特征。从基因利导的耐药模式上分析,六种耐药基因在CNS上的检出率都明显高于SA,但是所有耐药基因在SA中的有效性可达100%,CNS则不能。三分之一的CNS能对p-内酰胺药物耐药的机制在于其能产生p-内酰胺酶,CNS针对四环素的耐药则主要在于tetK、tetL介导的蛋白泵机制,其中依赖于tetK的比重最大。但是,只有四分之一的SA针对β-内酰胺药物耐药的机制在于其能产生p-内酰胺酶,而其他耐药基因扩增率则都很低。三、葡萄球菌中部分耐药基因失效原因的探究该研究中发现了其中部分菌株具有相关耐药基因但并不能有效耐药,菌株虽然不多,但是确实存在的。本研究主要从该类基因的碱基序列分析中着手去探究原因。将这些特殊基因和相应有耐药性的基因连接T载体送测序分析,结果表明,在扩增的blaZ基因中,七个无耐药性菌株的blaZ基因与具有耐药性菌株的blaZ基因序列相比具有很大差异,且在GenBank中未能搜索到结果,因此判定这七个序列应该是具有其他未知作用但目前尚未报道过的基因,同时该基因在本研究中其他葡萄球菌中并没有扩增得到,因此判定其在葡萄球菌中应该为非必要的基因。同样无耐药性的特殊基因tetK和tetL同实际上存在的有耐药性的tetK和tetL同源性很高,因此我们将它们都与PGEM-6P-1载体连接,检测耐药性。发现在扩增的tetK基因中,取自tetK有耐药性的阳性克隆株都对四环素表现耐药,但取自四环素敏感菌株MP00109中的tetK基因转化的克隆株依旧没有出现耐药性,说明这个tetK基因中出现的5个位点的突变很可能是其中的关键位点。而取自MP00101的tetK基因的克隆菌株则在抑菌圈内部有部分细菌生长,说明在其中还存在抗药的潜力,这点与MP00101中只有一个位点的突变相符,说明该位点决定的耐药性在抗生素的压力下存在回复突变的可能或是有其他位点的改变可以弥补缺失的耐药性；在扩增的tetL基因中,在菌株MP00213和MP00350中有效的tetL基因在克隆转化BL21后,转化菌对四环素只表现出了中介,四环素敏感菌株MP00368中的tetL克隆转化菌对四环素依旧呈现了敏感,因此推测该基因在BL21菌株中依旧起到了一定影响作用。综上所述可知,在江苏地区奶牛乳房炎引起的病原主要是葡萄球菌,但也出现了左氏无绿藻的感染。作为主要病原菌的葡萄球菌的耐药模式上可以看出,利用针对干扰核酸代谢的药物和针对影响蛋白合成的抗生素的合用或者氟苯尼考在控制葡萄球菌的感染上可能有较好的效果。而对耐药基因失效的原因,推断是细菌在繁殖过程中部分耐药基因出现了变异,这为细菌进一步耐药创造了条件,同时也产生某些不利于耐药的突变,导致耐药性减弱或消失。
【关键词】：奶牛乳房炎 葡萄球菌 耐药模式
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 符号说明10-11
• 文献综述11-22
• 1. 奶牛乳房炎概述11
• 2. 乳房炎病因11-13
• 2.1 病原微生物11-13
• 2.2 环境因素13
• 2.3 遗传因素13
• 2.4 营养因素13
• 2.5 管理因素13
• 3. 乳房炎治疗方法13-16
• 3.1 抗生素疗法14
• 3.2 中草药疗法14-15
• 3.3 生物疗法15
• 3.4 微生态制剂疗法15-16
• 3.5 细胞因子疗法16
• 4. 乳房炎源性葡萄球菌的抗生素耐药性16-21
• 4.1 葡萄球菌对内酰胺类药物的耐药性16-17
• 4.2 葡萄球菌对氨基糖甙类药物的耐药性17
• 4.3 葡萄球菌对大环内酯类、林可霉素类、链阳霉素类药物的耐药性17-18
• 4.4 葡萄球菌对四环素素类药物的耐药性18-19
• 4.5 葡萄球菌对喹诺酮类药物的耐药性19
• 4.6 葡萄球菌对磺胺类药物的耐药性19
• 4.7 葡萄球菌对酰胺醇类抗生素的耐药性19-21
• 5. 本研究的目的和意义21-22
• 研究内容一 江苏地区奶牛乳房炎的流行病原调查以及葡萄球菌的分离纯化22-28
• 1. 材料与方法22-24
• 1.1 试剂及培养基22
• 1.2 主要仪器22
• 1.3 奶样采集22-23
• 1.4 细菌的分离与纯培养23
• 1.5 生化鉴定23
• 1.6 选择性培养基培养23
• 1.7 PCR鉴定左氏无绿藻23
• 1.8 左氏无绿藻药物敏感性检验23-24
• 2. 结果24-26
• 2.1 细菌革兰氏染色结果24
• 2.2 细菌选择性培养基培养结果24-25
• 2.3 PCR鉴定左氏无绿藻和相关药敏结果结果25-26
• 2.4 细菌分离纯化结果26
• 3. 讨论26-28
• 3.1 乳房炎病原菌流行情况26
• 3.2 左氏无绿藻26-28
• 研究内容二 江苏地区奶牛乳房炎葡萄球菌耐药模式的探究28-37
• 1. 材料方法28-31
• 1.1 菌株28
• 1.2 主要仪器28
• 1.3 主要试剂与耗材28-29
• 1.4 细菌DNA模板制作29
• 1.5 耐药基因检测29-30
• 1.6 耐药基因的克隆及鉴定30
• 1.7 药敏试验30
• 1.8 数据分析30-31
• 2. 结果31-33
• 2.1 药敏结果31-32
• 2.2 多重耐药结果32
• 2.3 耐药基因检测结果及其与耐药表型的相互关系32-33
• 3. 讨论33-37
• 3.1 本研究中的葡萄球菌耐药表型的分析33-34
• 3.2 葡萄球菌耐药基因及其耐药模式的分析34-37
• 研究内容三 江苏地区奶牛乳房炎葡萄球菌部分耐药基因失效原因的探究37-44
• 1. 材料方法37-39
• 1.1 菌株37
• 1.2 主要仪器37
• 1.3 主要试剂与耗材37-38
• 1.4 引物的设计和目的片段的扩增38
• 1.5 耐药基因的克隆及鉴定38
• 1.6 序列测定结果的比较38
• 1.7 目的片段与原核表达载体的构建38-39
• 1.8 药敏试验39
• 2. 结果39-43
• 2.1 耐药基因BLAZ、ALL-TETK和ALL-TETL扩增和转化后酶切鉴定结果39-41
• 2.2 耐药基因BLAZ、ALL-TETK和ALL-TETL测序结果41-42
• 2.3 耐药基因ALL-TETK和ALL-TETL克隆株对四环素敏感性结果42-43
• 3. 讨论43-44
• 3.1 本研究中BLAZ基因不耐药的可能原因分析43
• 3.2 本研究中ALL-TETK和ALL-TETL基因不耐药的可能原因分析43-44
• 全文小结44-45
• 参考文献45-51
• 致谢51-52
• 攻读学位期间发表的学术论文目录52-53

【参考文献】

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