BoHV-5 miR-B10-3p诱饵系统的建立及应用

发布时间：2017-06-29 23:14

  本文关键词：BoHV-5 miR-B10-3p诱饵系统的建立及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：microRNA(miRNA)是一类长度大约在22 nt的没有编码功能的单链RNA分子,以碱基不完全配对或完全配对的方式结合靶m RNA,在转录后水平和翻译水平调控基因表达。miRNA在生物的几乎所有生理过程和病理过程中发挥重要的作用,包括胚胎发育、组织生长或再生、干细胞分化、癌症发生及许多免疫反应。牛疱疹病毒5型(Bovine herpesvirus 5,BoHV-5)是α疱疹病毒中的重要成员,有嗜神经性和潜伏感染的特性,使养殖业蒙受巨大的经济损失。在本课题组前期的研究中,借鉴高通量测序的数据进行分析,并验证在BoHV-5病毒的基因能够产生16个成熟的miRNA。其中BoHV-5 miR-B10的表达丰度最高,并且我们通过生物信息学预测,结果显示UL39可能受到该miRNA调控。然而编码miR-B10的基因位于BoHV-5基因组的末端重复区内,在基因组上有两个编码位点,因此要研究该miRNA的功能不能单纯的在对该编码位点直接进行缺失。在本研究中,我们首先验证了BoHV-5 miR-B10-3p与病毒自身的基因UL39的3′UTR区域的互作关系。通过细胞实验确认了BoHV-5 miR-B10-3p对UL39的3'UTR区域有下调作用后,我们建立了可调控的体内miRNA knock-down系统。该系统由可诱导的调控元件以及特异性吸附miRNA的元件两个部分构成。同时我们构建了能够反映miRNA相对含量的报告系统,对miRNA的量以及miRNA konck-down系统的效率进行验证,最终把miRNA knock-down系统整合到病毒基因组上,构建了含诱导表“miRNA诱饵”表达元件的重组病毒,抑制BoHV-5 miR-B10-3p的表达,进而研究这个miRNA的功能,并试图从miRNA角度阐释BoHV-5的神经致病机理,也可能为研制新型疫苗和药物提供新的思路和技术平台。本研究的主要内容如下:1.BoHV-5 miR-B10-3p与其靶基因UL39的3'UTR互作验证把靶基因UL39的3'UTR序列克隆到上荧光素酶报告质粒海肾荧光的多克隆位点区域,然后把BoHV-5 miR-B10-3 mimics和报告质粒共转染入细胞中,24小时后进行双荧光素酶分析,结果显示BoHV-5 miR-B10-3p能与其靶基因UL39的3'UTR区互作,并有显著的下调作用。2.构建含miRNA诱饵系统的质粒我们把Tet-on调控系统与能够吸附特异miRNA的诱饵元件(Tough Decoy,Tu D)串联起来实现对miRNA诱饵的可控表达。具体是把三个Tu D元件插入到EGFP的3'UTR区域,用Tet-on调控系统调控EGFP基因表达,从而实现对Tu D元件的可控表达。3.构建含miRNA诱饵系统的重组病毒本实验应用同源重组的原理,将构建好的含有基因组插入位点上下游同源臂的诱饵系统中间转移质粒和BoHV-5基因组以及辅助转移质粒共转染与细胞内,挑取含有荧光标记的重组型病毒经过空斑纯化筛选获取含miRNA诱饵系统的重组病毒。4.重组病毒miRNA诱饵系统功能的验证我们主要通过两个方面对诱饵系统的功能进行验证,一方面是重组病毒的生物学特性的研究,通过生物学特性的变化直接反映诱饵系统的效果;另一方面是通过荧光定量PCR和western blot对knock down相应miRNA后的效果进行定量检测。总而言之,本研究实验结果表明:(1)BoHV-5 miR-B10-3p能与其靶基因UL39的3'UTR区互作,并且起下调作用。(2)miRNA报告系统能特异性的报告相应miRNA的含量。(3)含有miRNA诱饵系统的重组病毒knock down相应的miRNA后病毒在细胞内的增殖减慢。(4)BoHV5 miR-B10-3p诱饵系统的下调效率约为50%。
【关键词】：牛疱疹病毒5型 microRNA TuD Tet-on
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略语表(Abbreviation)10-11
• 第1章 文献综述11-19
• 引言11
• 1.1 牛疱疹病毒5型（BoHV-5）的流行特性以及分子特性11-12
• 1.2 miRNA的生成机制及功能12-13
• 1.3 疱疹病毒表达的miRNA13-14
• 1.4 miRNA的功能研究14-15
• 1.5 miRNA诱饵15-17
• 1.6 四环素诱导系统17-18
• 1.7 研究目的与意义18-19
• 第2章 材料与方法19-35
• 2.1 实验材料19-24
• 2.1.1 载体、质粒、病毒、细胞、菌种及实验动物19
• 2.1.2 主要试剂19-20
• 2.1.3 主要溶液及培养基的配制20-23
• 2.1.4 本研究中所用的寡核苷酸引物23-24
• 2.2 试验方法24-35
• 2.2.1 PCR扩增方法24
• 2.2.2 DNA纯化分离的方法24-27
• 2.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测27
• 2.2.4 酶切后连接以及同源重组27
• 2.2.5 大肠杆菌感受态制备的方法27-28
• 2.2.6 转化28
• 2.2.7 细胞转染28-29
• 2.2.8 双荧光素酶报告试验29-30
• 2.2.9 RNA的抽提30
• 2.2.10 RNA的质量鉴定30-31
• 2.2.11 反转录与qPCR31-32
• 2.2.12 Western blot32-33
• 2.2.13 病毒滴度（PFU）的测定33-34
• 2.2.14 空斑筛选纯化34
• 2.2.15 空斑大小比较34
• 2.2.16 一步法生长曲线34-35
• 第3章 实验结果35-48
• 3.1 miR-B10-3p与病毒自身靶基因UL39的 3’UTR互作验证35
• 3.2 miRNA报告系统的构建以及功能的验证35-37
• 3.2.1 miRNA报告系统的设计35-36
• 3.2.2 miRNA报告系统功能的验证36
• 3.2.3 miRNA报告系统特异性的验证36-37
• 3.3 miRNA诱饵系统的构建37-40
• 3.4 含诱饵系统的重组病毒的构建40-44
• 3.4.1 含上下游同源臂的质粒构建40-41
• 3.4.2 中间转移质粒的构建及鉴定41-42
• 3.4.3 同源重组42
• 3.4.4 含诱饵系统的重组病毒的纯化以及鉴定42-44
• 3.5 重组病毒体外培养生物特性的研究44-46
• 3.5.1 空斑大小的比较44-45
• 3.5.2 一步法生长曲线45-46
• 3.6 重组病毒中诱饵系统的功能验证46-48
• 3.6.1 检测EGFP的表达量46-47
• 3.6.2 TaqMan法绝对定量qPCR检测诱饵系统对miRNA的吸附作用47-48
• 第4章 讨论与结论48-52
• 4.1 关于诱饵系统质粒的构建48-50
• 4.2 关于构建重组病毒50
• 4.3 关于病毒miRNA诱饵系统效率的检测50-51
• 4.4 结论51-52
• 参考文献52-58
• 致谢58

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