动物肠道源抗铅益生乳酸菌的分离、鉴定及其缓解铅毒性的机理研究

发布时间：2017-07-02 20:27

  本文关键词：动物肠道源抗铅益生乳酸菌的分离、鉴定及其缓解铅毒性的机理研究

  更多相关文章： 乳酸菌 筛选 铅 急性中毒 保护 肠粘膜屏障

【摘要】：铅(Lead,Pb)作为地球上分布广泛且含量丰富的重金属之一,同时也是最严重的环境污染物。铅属于机体非必需元素,尚未证实其具有营养性,但对机体的积累性毒害作用被广泛认同。铅蓄积在体内,可造成神经系统、生殖系统、免疫系统和造血等方面功能障碍,引起脑、肾、肝和神经等损伤。近年来,许多国家,尤其发展中国家,铅污染和铅中毒已成为广泛关注的公共健康问题。常规的螯合剂治疗和新兴起的营养干预治疗方法,存在具有明显副作用并且影响必需金属元素等弊端,所以,寻找一些新的策略对铅中毒,开发安全、有效、无毒副作用、绿色的新型解毒制剂或膳食补充剂将成为一种必然趋势。在治理重金属污染水源和土壤的领域,微生物吸附法因其操作简易、清除效率高、来源丰富、成本低、副产物少等优势而得到青睐和应用,能否应用微生物清除或缓解人或动物重金属毒性值得深入探讨。作为公认的食品安全级微生物,已有报道显示乳酸菌可以高效吸附重金属铅离子,缓解铅的毒性作用,但作用机制尚未完全明确。所以,本课题旨在筛选多种动物肠道来源能够在体外耐受重金属铅离子,并且具有优良益生性质的乳酸菌;进一步通过建立动物模型验证其在体内的功能,研究其缓解重金属铅中毒的作用机理,为开发利用乳酸菌作为重金属清除剂添加到动物饲料或食品中奠定理论和物质基础。以下为主要研究结果:首先,利用含Pb2+MRS固体培养基,从多种健康动物肠道分离乳酸菌,通过革兰氏染色、形态观察、触酶试验的初步筛选,共得到38株符合标准的菌株。这些菌株均具有很强的铅耐受能力,最大耐受铅离子浓度可达到2 000 mg/L;在600 mg/L铅离子溶液中,对铅吸附率均在60%以上,最高可到84%。进而,模拟体外胃肠道环境,进行耐受强酸、强碱、胆盐和胰蛋白酶的测定,筛选出20株符合标准的菌株,其中的5株对常见的五种病原菌具有良好的抑制效果。随之,对这5株具有优良益生性质的菌株进行16S rRNA鉴定,确定菌株分别是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。最后,测定对清除羟自由基、清除DPPH自由基以及还原能力,证实这5株乳酸菌具有一定的抗氧化能力。其中,罗伊氏乳杆菌21008菌株铅耐受能力和吸附能力、益生性质、体外抗氧化能力表现最为突出,所以,选择罗伊氏乳杆菌21008菌株进行后续试验。之后,通过建立重金属铅急性中毒小鼠模型,评价口服罗伊氏乳杆菌21008对铅中毒的缓解效果,并解析其缓解铅毒性的机制。分别设立对照组、LAB-5d组(先灌喂5d乳酸菌,之后染毒)、MRS-5d组(先灌喂5d MRS,之后染毒)、LAB-12d组(先灌喂5d乳酸菌,之后染毒,并持续灌喂乳酸菌12d)和MRS-12d组(先灌喂5d MRS,之后染毒,并持续灌喂MRS 12d),检测肝脏、肾脏和粪便中铅的含量,组织病理学变化的观察,氧化应激检测,检测相关mRNA表达水平和炎症相关信号通路的蛋白表达水平,通过这些指标对灌喂罗伊氏乳杆菌21008缓解铅毒性的机制进行探究。结果表明,灌喂罗伊氏乳杆菌21008能明显缓解急性铅中毒小鼠体重降低,减轻急性铅毒性导致的机体病理损伤,保护小鼠肠道粘膜屏障。灌喂罗伊氏乳杆菌21008不但能够降低肝脏和肾脏中铅的含量,还能促进铅随粪便排出,从而抑制肠道对铅的吸收,保护肠道免受铅毒性引起的病理损伤。同时,罗伊氏乳杆菌21008可以缓解铅中毒引起的氧化应激,促进有关检测指标趋于健康对照组,降低铅毒性导致的机体氧化损伤。另外,罗伊氏乳杆菌21008可以降低急性铅中毒引发炎症因子(如IL-6,IFN-γ和TNF-α等)转录水平,提高抗炎因子(如IL-10等)转录水平,并且提高肠道紧密连接因子的转录水平,表明罗伊氏乳杆菌21008在体内可以抑制铅毒性引发的炎症反应,并且维护肠道粘膜屏障。试验还发现,罗伊氏乳杆菌21008具有调节炎症相关信号通路P38 MAPK和NF-κB的蛋白表达,促进机体对铅的解毒作用。值得注意的是,LAB-12d组在肝肾中铅含量高于MRS-12d组,推测与乳酸菌吸附铅并定植于肠道造成重新吸收有关。本研究进一步验证乳酸菌具有缓解铅急性毒性作用,其保护机制与维护肠黏膜屏障功能、调节细胞因子表达、减缓氧化应激等有关,其保护性作用可能是通过调节P38 MAPK和NF-κB信号通路而实现的。罗伊氏乳杆菌21008有望作为绿色安全的生物制剂用于预防或治疗铅中毒,为下一步开发乳酸菌作为重金属清除剂添加到动物饲料或食品中奠定基础。
【关键词】：乳酸菌 筛选 铅 急性中毒 保护 肠粘膜屏障
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S816
【目录】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-15
• 1 前言15-21
• 1.1 重金属铅的概述15
• 1.2 重金属铅的危害15-16
• 1.2.1 对环境的影响15
• 1.2.2 对机体的危害15-16
• 1.3 治疗铅中毒的方法16-17
• 1.3.1 螯合剂疗法16
• 1.3.2 营养干预或膳食疗法16-17
• 1.3.3 现有疗法的弊端17
• 1.4 微生物吸附重金属的研究进展17-18
• 1.5 乳酸菌抗重金属机制的研究进展18-19
• 1.5.1 乳酸菌对重金属的吸附与去除18
• 1.5.2 乳酸菌缓解机体的氧化应激18
• 1.5.3 乳酸菌对机体肠道黏膜免疫的调节作用18-19
• 1.5.4 乳酸菌的益生作用19
• 1.6 研究目的和意义19-21
• 2 材料与方法21-31
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 试验试剂与菌种21
• 2.1.2 试验动物21
• 2.1.3 引物合成21-22
• 2.1.4 试验仪器和设备22-23
• 2.2 耐铅乳酸菌的分离和筛选23
• 2.2.1 样品采集和耐铅乳酸菌的分离23
• 2.2.2 耐铅乳酸菌的表型鉴定23
• 2.2.3 耐铅乳酸菌的稳定性和耐受性23
• 2.3 耐铅乳酸菌体外益生特性的测定23-25
• 2.3.1 强酸耐受试验23-24
• 2.3.2 耐胆盐试验24
• 2.3.3 耐胰蛋白酶试验24
• 2.3.4 抑菌试验24
• 2.3.5 耐铅乳酸菌体外抗氧化试验24-25
• 2.4 耐铅乳酸菌药敏试验25-26
• 2.5 耐铅乳酸菌对铅的吸附试验26
• 2.6 耐铅乳酸菌分子生物学鉴定26
• 2.7 动物试验26-27
• 2.7.1 小鼠醋酸铅半数致死量的确定26-27
• 2.7.2 试验设计27
• 2.8 样品采集27-28
• 2.8.1 粪便样品采集27
• 2.8.2 组织样品采集27-28
• 2.9 样品处理28
• 2.9.1 RNA处理28
• 2.9.2 蛋白样品的处理28
• 2.10 检测指标28-30
• 2.10.1 体重变化监测28
• 2.10.2 病理变化检测28-29
• 2.10.3 铅含量检测29
• 2.10.4 抗氧化指标检测29
• 2.10.5 mRNA表达水平检测29
• 2.10.6 P38 MAPK和NF-κB信号通路相关蛋白表达检测29-30
• 2.11 数据分析30-31
• 3 结果31-60
• 3.1 耐铅乳酸菌的筛选结果31
• 3.1.1 耐铅乳酸菌的表型特征31
• 3.1.2 耐铅乳酸菌的铅耐受性与稳定性31
• 3.2 耐铅乳酸菌益生性质测定结果31-33
• 3.2.1 强酸耐受性质测定结果31
• 3.2.2 胆盐耐受性质测定结果31
• 3.2.3 胰蛋白酶耐受性质测定结果31-32
• 3.2.4 抑制细菌能力测定结果32
• 3.2.5 体外抗氧化试验结果32-33
• 3.3 耐铅乳酸菌药敏试验结果33
• 3.4 耐性乳酸菌对铅的吸附试验结果33
• 3.5 分离菌株的分子生物学鉴定结果33-34
• 3.6 动物试验34-60
• 3.6.1 铅对小鼠半数致死量的测定34
• 3.6.2 体重的检测结果34-35
• 3.6.3 病理学观察结果35-39
• 3.6.4 体内残留铅含量的检测结果39-42
• 3.6.5 各组织中抗氧化能力检测结果42-45
• 3.6.6 mRNA表达检测结果45-55
• 3.6.7 P38 MAPK和NF-κB信号通路相关蛋白表达检测结果55-60
• 4 讨论60-66
• 4.1 课题设计思路60
• 4.2 乳酸菌的益生特性60-61
• 4.3 乳酸菌对机体的保护作用61-65
• 4.3.1 乳酸菌缓解铅毒性导致的病理损伤61-62
• 4.3.2 乳酸菌缓解铅毒性导致的氧化应激62-63
• 4.3.3 乳酸菌缓解铅毒性导致的炎症反应63
• 4.3.4 乳酸菌调节肠道粘膜屏障相关细胞因子表达63-64
• 4.3.5 乳酸菌缓解铅毒性导致的炎症相关信号通路相关蛋白表达64-65
• 4.4 展望65-66
• 5 结论66-67
• 致谢67-68
• 参考文献68-75
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文75

  本文关键词：动物肠道源抗铅益生乳酸菌的分离、鉴定及其缓解铅毒性的机理研究

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本文编号：511139