水貂呼肠孤病毒分离鉴定及反向遗传初步研究

发布时间：2017-07-02 21:11

  本文关键词：水貂呼肠孤病毒分离鉴定及反向遗传初步研究

  更多相关文章： 呼肠孤病毒 水貂 病毒分离 血清学调查 反向遗传学

【摘要】：20世纪50年代呼肠孤病毒的发现,首次证实了双链RNA病毒可作为稳定的生命形式存在于自然界,由于主要从呼吸道或肠道中分离出此病毒,并且当时对它的致病作用不清楚,所以称它为呼吸道、肠道、孤儿病毒,简称呼肠孤病毒(Reovirus)。哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian Orthoreovirus,MRV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridea)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)成员,病毒粒子无囊膜,二十面体对称,具有双层衣壳。基因组由10条双链RNA组成,分为3个大片段(L1~L3)、3个中片段(M1~M3)以及4个小片段(S1~S4),共编码8种结构蛋白和3种非结构蛋白。MRV有4个主要的血清型,其代表株为血清1型Lang(T1L)、血清2型Jones(T2J)、血清3型Dearing(T3D)以及血清4型Ndelle(T4N)。目前有关水貂呼肠孤病毒的报道较少,1975年德国研究人员首次从水貂中分离到一株呼肠孤病毒,1992年刘维全等在国内首次报道了一株从水貂中分离的呼肠孤病毒,2011年连海等首次从水貂中分离到一株血清1型呼肠孤病毒HB-A株。虽然大多数呼肠孤病毒感染并没有明显症状或症状较轻,但是该病毒可能与其他病毒混合感染从而加重病情,造成水貂生长迟缓、被毛粗乱,严重影响貂皮的质量,从而给养殖业造成损失。反向遗传学技术已经广泛应用于病毒学研究的各个领域,极大推动了病毒学发展。与经典的从表型改变到进行基因功能研究的思路相反,反向遗传技术是指通过构建RNA病毒的感染性克隆,在病毒cDNA分子水平上对其进行人工体外操作,如进行基因突变、缺失、插入、置换等改造,从而研究RNA病毒的基因复制与表达调控机制、病毒和宿主细胞的相互作用关系、抗病毒策略和基因治疗,以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行新疫苗研制等,因此对RNA病毒进行遗传拯救已成为分子病毒学研究的必经之路。然而,呼肠孤病毒基因组的复杂性妨碍了其反向遗传系统的建立,也制约了病毒各方面的研究。2014年山东某貂厂发生以腹泻症状为主的疾病,取肠道内容物接种于BHK-21和Vero细胞,经盲传,细胞出现了变圆、脱落等病变。经电镜观察,观察到无囊膜、二十面体对称、双层衣壳和直径约75 nm的病毒粒子。RT-PCR和BLAST结果表明,病毒粒子为哺乳动物正呼肠孤病毒,命名为MRV3 SD-14株。测定了SD-14株的病毒滴度、血凝性以及致病性,SD-14株在BHK-21和Vero细胞上的tcid50为105.625tcid50/ml和105tcid50/ml;sd-14株在4℃、室温以及37℃条件下,对人o型血红细胞以及鸡、豚鼠、牛和兔的红细胞均不发生凝集反应;将sd-14株经口和脑内接种乳鼠,对乳鼠不致病,对其生长没有明显影响。设计特异引物,经rt-pcr获得了sd-14株全基因组序列,并将序列提交到genbank数据库中,登录号为kt224504-kt224513。序列分析结果表明,sd-14株为血清3型呼肠孤病毒,其l1、l3、m3和s3与人源mrv2tou05株有较高相似度,分别为97.40%,96.92%,97.09%和97.20%;s2与t1l标准株有较高相似度,为96.17%;l2、m2及s1与猪源的gd-1株有较高相似度,分别为97.39%、98.37%和98.66%;m1和s4与猪源的sc-a株有较高相似度,分别为95.53%和97.58%。此外,sd-14株与貂源的hb-a株具有高度的序列相似性。综合序列的相似性以及根据每个片段所构建的进化树,推测sd-14株为人源、猪源以及貂源呼肠孤病毒混合感染产生的新的重组病毒。此外,序列分析显示,sd-14株的s1片段第246个密码子为终止密码子,可能造成σ1蛋白翻译提前终止,从而对病毒的生物学特性产生影响。sd-14株是首次从水貂中分离获得的血清3型呼肠孤病毒,sd-14株的分离丰富了水貂呼肠孤病毒的基因库以及生物特性,对于研究呼肠孤病毒在水貂群中的流行、进化等具有重要意义。为了解呼肠孤病毒在水貂群中的感染情况,本实验采用微量中和试验调查了山东、河北以及吉林水貂群中呼肠孤病毒的血清抗体水平,以期从抗体水平了解呼肠孤病毒感染的流行状况。结果表明,血清阳性率分别为:山东92.5%,河北82.1%,吉林91.7%,表明该病毒在上述地区水貂群中具有较高水平的感染率。建立呼肠孤病毒反向遗传操作平台,是深入研究该病毒的蛋白功能以及致病机制的关键途径。本研究首先对呼肠孤病毒hb-a株进行了全基因组测序,以确定病毒真实的cdna序列,为下一步构建全长cdna克隆提供参考。通过rt-pcr获得呼肠孤病毒hb-a株全基因组10个片段,将其分别插入含t7rna聚合酶启动子、丁肝病毒核酶以及t7rna聚合酶终止子的表达盒中,获得10个重组质粒pcdna-t7-l1、pcdna-t7-l2、pcdna-t7-l3、pcdna-t7-m1、pcdna-t7-m2、pcdna-t7-m3、pcdna-t7-s1、pcdna-t7-s2、pcdna-t7-s3和pcdna-t7-s4,同时将l1片段2193位的t突变为c,作为分子标记,以区分野毒和重组毒。此外,将σ1s蛋白的起始密码子由atg突变为acg,使σ1s蛋白不表达,为构建σ1s蛋白缺失突变型呼肠孤病毒做准备。将10个重组质粒按照合适的配比浓度共转染bhk-t7细胞系,37℃培养3~5d,收获细胞并反复冻融3次,在bhk-21细胞上进行传代。本研究首次分离到一株貂源血清3型呼肠孤病毒mrv3sd-14株,并对其增殖、感染和血凝等生物学特性进行了鉴定;对山东、河北、吉林等地水貂群的呼肠孤病毒感染率进行了血清学调查,证实该病毒感染在上述地区水貂群中普遍存在;进行了呼肠孤病毒HB-A株反向遗传初步研究,为呼肠孤病毒感染、重组和致病机制研究奠定了一定基础。
【关键词】：呼肠孤病毒 水貂 病毒分离 血清学调查 反向遗传学
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 英文缩写词表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 第一章 呼肠孤病毒MRV3 SD-14株的分离鉴定15-45
• 1 材料与方法15-25
• 1.1 材料15-17
• 1.2 方法17-25
• 2 结果25-39
• 2.1 病毒的CPE特征25-26
• 2.2 病毒电镜观察结果26-27
• 2.3 病毒RT-PCR鉴定结果27
• 2.4 病毒滴度27
• 2.5 病毒血凝性27-28
• 2.6 病毒致病性28
• 2.7 病毒全基因组分析28-39
• 3 讨论39-40
• 4 小结40-42
• 参考文献42-45
• 第二章 我国部分地区水貂群中呼肠孤病毒中和抗体调查45-51
• 1 材料与方法45-47
• 1.1 材料45-46
• 1.2 方法46-47
• 2 结果47-48
• 2.1 血清阳性率47-48
• 3 讨论48
• 4 小结48-50
• 参考文献50-51
• 第三章 呼肠孤病毒HB-A株全基因组cDNA克隆的构建51-69
• 1 材料与方法51-61
• 1.1 材料51-53
• 1.2 方法53-61
• 2 结果61-64
• 2.1 全基因组cDNA的获得61-62
• 2.2 克隆载体的鉴定62
• 2.3 全基因组cDNA克隆的鉴定62-63
• 2.4 L1遗传标记的鉴定63-64
• 2.5 S1突变位点的鉴定64
• 3 讨论64-66
• 4 小结66-67
• 参考文献67-69
• 个人简历69-70
• 致谢70

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