犬细小病毒灭活疫苗的制备及效果观察

发布时间：2017-07-02 22:01

  本文关键词：犬细小病毒灭活疫苗的制备及效果观察

  更多相关文章： 犬细小病毒 灭活疫苗 免疫效果

【摘要】：犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)感染普遍存在于世界各地犬科动物中,引起较高的发病率和死亡率,导致养犬业及宠物业经济损失惨重,对野生动物的生存也产生了非常大的影响,而目前对该病尚未发现有效的治疗对策,疫苗的开发免疫是有效预防CPV流行的关键,但CPV存在抗原漂移,所以根据CPV流行和抗原特异性来制备相应的灭活疫苗,对预防目前国内CPV的流行意义重大。本试验首先将实验室近来分离保存的CPV-S5(New CPV-2a基因亚型)与CPV-1401(New CPV-2b基因亚型)毒株分别在F81细胞上扩大培养,通过病毒培养条件的优化试验确定CPV的最佳生长条件,以此培养较高滴度且足够量的病毒液来制备浓缩与未浓缩灭活疫苗;接着通过高浓度盐离心浓缩与小型切向流超滤浓缩两种浓缩方法对细胞培养液进行浓缩;之后将浓缩的病毒液与未浓缩的病毒液与终浓度为0.05%β-丙内脂4℃条件灭活24h,37℃水浴2h;经在F81细胞上进行灭活鉴定后,参考本实验室刘晓慧制备疫苗的方法,将水溶性佐剂MONTANIDE GEL和灭活病毒液按1:9比例混合,再通过无菌及理化性质的鉴定,结果显示所做的三批疫苗所用的病毒液均灭活成功,无菌鉴定阴性,外观透明无浑浊现像,免疫犬后均未见明显的临床副反应,且有效的刺激犬产生特异性免疫应答,表明成功制备了安全、有效的浓缩CPV与未浓缩CPV水溶剂灭活疫苗。将第一批水溶剂灭活疫苗和商品化犬细小弱毒苗分别接种5周龄未免疫且HI抗体效价阴性的幼犬,分别在免疫后0 d、7d、14 d、21d、28 d通过HI试验对处理过的血清进行抗体效价测定,结果显示所有免疫组在第7d都能产生高于1:80的HI抗体效价,浓缩组要显著高于未浓缩组,初步表明CPV灭活疫苗效果与抗原的浓度有直接的关系;灭活疫苗组与商品化弱毒苗组均差异显著。对试验犬免疫36d后进行攻毒实验,攻毒后20d内,免疫组的犬均未见明显临床症状,仅2只犬产生轻微症状但最终耐过,而HI抗体效价阴性犬死亡,经检测死亡犬CPV为阳性,表明制备的CPV灭活疫苗产生的特异性免疫应答能抵抗强毒的攻击,对犬起到很好的免疫保护。对攻毒过后的犬继续加强免疫第二批灭活疫苗,加强免疫10d后对所有犬CPV检测,过后取高免血清,结果显示CPV阴性且高免血清平均HI效价为1:3072。灭活疫苗首免抗体效价及持续时间有限需加强免疫,故首免36d后进行二免,结果显示其HI抗体效价极显著提高,有效抗体能维持6个月,进一步有效的对免疫犬群进行保护。将第三批水溶剂灭活疫苗分别接种3月龄未免疫且HI效价阴性的比格犬,分别在7d、14 d、21d、28 d通过HI试验对处理过的血清进行抗体效价测定,结果显示犬在第7d的HI抗体效价达到1:448,其抗体消长规律与第一批浓缩CPV-S5灭活疫苗组总趋势一样,表明制备的灭活疫苗免疫效果重复性较稳定,且进一步证明其免疫效果与抗原浓度有直接关系。
【关键词】：犬细小病毒 灭活疫苗 免疫效果
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.292
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 1 前言12-17
• 1.1 CPV生物学特性12-13
• 1.2 CPV的分子生物学特性13
• 1.3 CPV抗原检测研究13-14
• 1.3.1 电镜观察13
• 1.3.2 血凝试验（HA）13-14
• 1.3.3 聚合酶链式反应（PCR）14
• 1.3.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）14
• 1.4 CPV抗体检测研究14-15
• 1.4.1 血凝抑制试验（HI）14
• 1.4.2 中和试验（SN）14-15
• 1.5 CPV的预防治疗15
• 1.6 疫苗研究进展15-16
• 1.6.1 弱毒疫苗与灭活疫苗15-16
• 1.6.2 基因工程疫苗与核酸疫苗16
• 1.7 本研究目的与意义16-17
• 2 材料与方法17-27
• 2.1 材料17-19
• 2.1.1 细胞、毒株和商品化疫苗17
• 2.1.2 主要试剂及耗材17
• 2.1.3 主要仪器17-18
• 2.1.4 培养基及主要溶液的配制18-19
• 2.1.5 实验动物19
• 2.2 方法19-27
• 2.2.1 疫苗的制备及免疫预防19-27
• 2.2.1.1 引物设计19
• 2.2.1.2 F81细胞的复苏、传代培养与冻存19-20
• 2.2.1.3 CPV培养接毒量和生长曲线的确定20
• 2.2.1.4 CPV的鉴定20-22
• 2.2.1.5 病毒的增殖培养22
• 2.2.1.6 HA抗原制备22
• 2.2.1.7 HA实验22
• 2.2.1.8 病毒的浓缩22-23
• 2.2.1.9 病毒的灭活23
• 2.2.1.10 CPV灭活效果检测23
• 2.2.1.11 灭活CPV与佐剂混合23-24
• 2.2.1.12 疫苗的检验24-25
• 2.2.1.13 CPV灭活疫苗免疫25-26
• 2.2.1.14 免疫保护性实验26
• 2.2.1.15 第三批疫苗免疫26-27
• 2.2.2 高免血清的制备27
• 2.2.2.1 免疫方案27
• 2.2.2.2 HI检测抗体水平27
• 2.2.2.3 颈动脉插管放血27
• 2.2.2.4 高免血清的处理27
• 2.2.3 数据处理27
• 3 结果与分析27-40
• 3.1 CPV的增殖27-28
• 3.2 细胞培养液PCR检测28-29
• 3.3 CPV生长曲线的确定29-30
• 3.4 病毒的浓缩30-31
• 3.5 CPV的灭活效果检验31
• 3.6 灭活疫苗的制备31
• 3.7 灭活疫苗实验室检验31-32
• 3.7.1 无菌检验31-32
• 3.7.2 稳定性与剂型检测32
• 3.8 抗体消长规律32-36
• 3.9 二免后抗体消长规律36-37
• 3.10 攻毒实验37-39
• 3.10.1 攻毒剂量37-38
• 3.10.2 攻毒结果38
• 3.10.3 攻毒后犬粪便PCR检测38-39
• 3.11 第三批疫苗的免疫效果39
• 3.12 高免血清制备39-40
• 4 讨论40-44
• 4.1 CPV灭活疫苗的制备40-41
• 4.2 CPV灭活疫苗的免疫效果41-44
• 全文总结44-45
• 致谢45-46
• 参考文献46-50
• 附录：攻读硕士期间发表学术论文50

  本文关键词：犬细小病毒灭活疫苗的制备及效果观察

  更多相关文章： 犬细小病毒 灭活疫苗 免疫效果

，

本文编号：511396