猪cGAS基因的克隆与原核表达

发布时间：2017-07-03 08:24

  本文关键词：猪cGAS基因的克隆与原核表达

  更多相关文章： 猪cGAS 非酶连接 丙酸诱导 原核表达

【摘要】：【目的】环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS)是近期在哺乳动物细胞中发现的一种新型核酸转移酶,能够识别胞质DNA,催化ATP和GTP生成第二信使c GAMP,继而通过STING依赖的方式活化转录因子IRF3,启动机体固有免疫。通过构建含猪c GAS基因的重组质粒p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS,进行原核表达,得到c GAS蛋白,为进行体外催化合成c GAMP及探讨其在天然免疫过程中的作用奠定基础。【方法】以猪脾脏c DNA为模板克隆猪c GAS的蛋白编码区(open reading frame,ORF),用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体p Bb B3a-His6-Nus A-LIC中。菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序。将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。当细菌生长到对数期时,丙酸钠诱导表达His6-Nus A-c GAS融合蛋白,用20 mmol·L~(-1)丙酸钠在20℃,180 r/min分别诱导0、2、4、6、8、10 h,以确定最佳诱导时间;然后,分别用0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol·L~(-1)的丙酸钠在20℃,180 r/min诱导6 h,以确定最佳诱导丙酸钠诱导浓度;另外,分别在20℃,30℃,37℃条件下用20 mmol·L~(-1)丙酸钠,180 r/min培养6 h,以确定最佳诱导温度。筛选最佳诱导条件,并用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。【结果】(1)本试验成功克隆了猪c GAS基因,其ORF长度为1 494 bp;(2)构建了c GAS丙酸诱导型原核表达载体p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS;(3)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在37℃,添加20 mmol·L~(-1)丙酸钠,诱导6 h时表达量最高。(4)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表达,相对分子质量为111.87 k D。【结论】运用大肠杆菌表达系统成功表达了c GAS融合蛋白,本试验为体外表达c GAS融合蛋白提供技术方法。
【作者单位】： 河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室;
【关键词】： 猪cGAS 非酶连接 丙酸诱导 原核表达
【基金】：农业部“948”重点计划(2011-G35) 河南省重点科技攻关(112102310705)
【分类号】：S852.2
【正文快照】： 0引言【研究意义】进入哺乳动物细胞质的DNA被机体固有免疫系统认为是一种潜在的病原信号,当机体感知到胞质中的DNA时,可触发固有免疫反应,产生I型干扰素和其他细胞因子[1-5]。但一直以来,对于固有免疫系统如何感知胞质DNA的机制尚不明确。环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic gua

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王黎霞;王彩霞;徐赓;安健;;鸡白细胞介素-2原核表达与生物学活性初探[J];动物医学进展;2009年11期

2 哲名家;张淼涛;云涛;王玢tx;刘光清;;兔岩藻糖基转移酶基因的克隆与原核表达[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2012年04期

3 谢海燕,郭霄峰;猪α-干扰素的原核表达[J];华南农业大学学报;2004年04期

4 孙东波;冯力;刘杰;时洪艳;佟有恩;刘胜旺;童光志;;猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析[J];病毒学报;2006年02期

5 张桂红;林海波;詹国英;廖明;任涛;罗开健;曹伟胜;徐成刚;江经纬;辛朝安;;猪白细胞介素-6基因的非融合原核表达研究[J];中国预防兽医学报;2006年04期

6 戴华;郑佳玉;陈俊华;潘志明;焦新安;;鸡α干扰素基因的原核表达及其活性测定[J];中国预防兽医学报;2009年10期

7 宋海韬;王力刚;沈兴家;黄勇;赵巧玲;;家蚕丙酮酸脱氢酶激酶基因的克隆与原核表达[J];江西农业学报;2011年10期

8 刘洪贵;杨颗粒;武瑞;王建发;张敏;林玉才;;金黄色葡萄球菌A蛋白的原核表达及其功能研究[J];中国兽医杂志;2009年10期

9 王黎霞;王彩霞;徐赓;安健;;鸡干扰素-γ的原核表达与生物活性[J];中国兽医杂志;2010年03期

10 田英;刘廷旭;赵彩平;韩明玉;智军海;;桃脂氧合酶基因的原核表达分析[J];西北植物学报;2011年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 马文涛;闫若潜;吴志明;刘光辉;盛敏;谢彩华;;猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究[A];中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会论文集(下册)[C];2010年

2 丁梦蝶;鲁丹;王红宁;田浪;阳泰;张毅;樊汶樵;郭自成;;禽传染性支气管炎病毒多基因串联表位抗原的原核表达研究[A];四川省动物学会第九次会员代表大会暨第十届学术研讨会论文集[C];2011年

3 林海波;张桂红;詹国英;廖明;任涛;罗开健;曹伟胜;徐成刚;辛朝安;;猪白细胞介素-6基因的非融合原核表达研究[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年

4 隋桂琴;左玲;王桂云;;人碱性成纤维细胞生长因子的原核表达[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年

5 黄斯勇;梁英民;韩骅;李国辉;伍艳兰;康志杰;何飞;张萍;徐恒;刘利;;人Detla-like4ext-93-217原核表达、纯化及蛋白活性检测[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

6 张红;刘志国;屈伸;;人源受体相关蛋白的原核表达优化及功能检测[A];湖北省暨武汉生物化学与分子生物学学会第八届会员代表大会和第十五次学术年会论文摘要汇编[C];2004年

7 袁志栋;王志亮;刘雨田;吴晓东;刘海生;;水貂朊蛋白前体基因的克隆与原核表达[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年

8 王士友;张耀洲;;一个新的家蚕基因的克隆、原核表达及纯化[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年

9 伍艳兰;黄斯勇;牛晓丽;张丽;陈茹菲;何飞;张萍;梁英民;刘利;;人Delta-like4ext-93-217原核表达、纯化及蛋白活性检测[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

10 马文涛;闫若潜;吴志明;刘光辉;盛敏;谢彩华;;猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会论文集[C];2010年

中国博士学位论文全文数据库 前8条

1 张晓鸣;人IL-16的原核表达与其功能的初步研究[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2000年

2 曹秀利;杨树PtCDD基因的原核表达及酶活分析[D];南京林业大学;2008年

3 黄新河;小鼠TAp63γ的原核表达、纯化、结构及功能初步研究[D];四川大学;2007年

4 张大鹏;VP60蛋白的原核表达、抗体制备及VP60基因转化的研究[D];西北农林科技大学;2012年

5 张少斌;豌豆肌动蛋白异型体（PEAc1）的原核表达及其藻荧光探针的研制[D];中国农业大学;2004年

6 尹国华;利用Red重组系统构建dsRNA原核表达体系抗烟草花叶病毒的研究[D];山东农业大学;2009年

7 韩凌霞;猪圆环病毒2型基因的原核表达与单克隆抗体的制备及感染性分子克隆的动物接种试验[D];中国农业科学院;2003年

8 于扬;重组人源GPx4及其模拟物的原核表达、结构与功能的研究[D];吉林大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 周鹏;结核分枝杆菌特异性蛋白的原核表达、纯化及免疫原性分析[D];安徽医科大学;2015年

2 高小磊;六种结核分枝杆菌特异性抗原的原核表达及16 KD-38 KD和Ag85A血清学诊断效果的研究[D];兰州大学;2015年

3 彭传林;家蝇抗真菌肽MAF-1原核表达体系优化与活性分析[D];贵阳医学院;2015年

4 钟树怀;猪囊尾蚴膜联蛋白的原核表达及其免疫反应性分析[D];贵阳医学院;2015年

5 孙明潭;猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF7基因的原核表达及ELISA方法的建立[D];河北农业大学;2015年

6 张良斌;天祝白牦牛KAP家族基因克隆、原核表达及其在皮肤中的表达分析[D];西北民族大学;2015年

7 达小强;牦牛转铁蛋白基因克隆与原核表达[D];西北民族大学;2015年

8 高翠娥;飞蝗2个CYP450转基因果蝇品系对杀虫剂的敏感性及原核表达[D];山西大学;2015年

9 吴雨航;布氏杆菌病间接ELISA方法的建立及吉林省梅花鹿主要养殖地区鹿布病血清学调查[D];吉林农业大学;2015年

10 姜旭;百合无症病毒16kDα基因的克隆、原核表达及亚细胞定位[D];大连理工大学;2015年

  本文关键词：猪cGAS基因的克隆与原核表达

  更多相关文章： 猪cGAS 非酶连接 丙酸诱导 原核表达

，

本文编号：512963