猪CYP3A22和CYP3A46催化T-2毒素羟化代谢的关键位点鉴定

发布时间：2017-07-04 05:11

  本文关键词：猪CYP3A22和CYP3A46催化T-2毒素羟化代谢的关键位点鉴定

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【摘要】：细胞色素P450氧化酶(Cytochrome P450,CYP)是由一类与结构和功能相关的同工酶构成的亚铁血红素—硫醇盐蛋白超家族,广泛存在于自然界的生物体中。它参与内源性物质的氧化、过氧化以及还原代谢作用和包括临床上90%的药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。T-2毒素是单端孢霉烯族化合物中性质最稳定、毒性最强的毒素之一,广泛分布于玉米、小麦和食品添加剂中。喂食被T-2毒素污染的饲料能使畜禽中毒,严重者甚至死亡。毒素在畜禽体内的代谢物可以通过农副产品间接威胁到人类的健康。而猪是我国农场和消费市场占有量最大的动物之一,它更容易受到T-2毒素的污染和毒害。羟化反应是T-2毒素在动物体内发生的主要代谢反应之一,也是影响其毒性大小的关键反应之一。前期的研究发现,在猪体内,CYP 3A家族基因(CYP3A22、CYP3A46和CYP3A29)能催化T-2毒素或HT-2毒素发生羟化反应。其中CYP3A29催化T-2毒素羟化代谢成3’-OH-T-2的关键位点已经初步阐明,然而CYP3A22和CYP3A46的羟化代谢T-2毒素的关键位点尚不清楚。目的和手段:本研究将通过异源表达、纯化、计算机同源建模、分子对接、定点突变和活性检测等方法,在体外获得天然构象、稳定活性的猪的CYP 3A家族蛋白的基础上,特别是对CYP3A22和CYP3A46催化T-2毒素羟化代谢中的关键位点进行深入研究。结果:1、通过不同异源表达体系的摸索和优化,最终在体外哺乳动物细胞表达体系中获得了具有稳定催化T-2毒素羟化代谢能力的猪CYP3A家族蛋白;2、在猪CYP3A家族与T-2毒素分子对接的实验中,初步筛选出CYP3A22可能发挥羟化代谢的关键位点为Met-57、Arg-105、Arg-106、Ser-119、Arg-212、Phe-213、Asp-214、Phe-215、Ala-305、ILe-301、Thr-309、ILe-369、Ala-370、Ala-371、Arg-372、GLy-481和Ile-483这17个残基,其中Phe-213、Thr-309和Gly-481 3个残基多次与T-2毒素分子形成氢键。CYP3A46可能发挥羟化代谢的关键位点为Phe-108、Phe-304、Pro-371、Ala-305、Thr-370、Lys-212、Phe-215、Phe-213、Arg-372、Arg-106、Arg-105、Glu-374和Leu-373这13个残基,其中Lys-215、Phe-213和Glu-374 3个残基多次与T-2毒素分子形成氢键。3、对猪CYP3A46催化T-2毒素羟化代谢中的关键位点进行深入研究,发现F213A、F215A和E374A突变体羟化代谢T-2毒素能力丧失;R106A、F108A和T370A这三个突变体代谢能力下降非常显著;突变体K212A代谢产物量也有减少,约为野生型的75%。以上结果提示Arg-106、Phe-108、Phe-213、Phe-215、Thr-370和Glu-374是影响T-2毒素羟化代谢的关键位点,Lys-212可能是影响T-2毒素进入活性区域的位点。
【关键词】：猪 T-2毒素 CYP3A家族 分子对接 定点突变
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文缩略词7-10
• 1 前言10-20
• 1.1 细胞色素P450氧化酶概述10-12
• 1.1.1 细胞色素P450氧化酶的命名与分布10
• 1.1.2 细胞色素P450氧化酶的结构特征及催化机制10-11
• 1.1.3 细胞色素P450氧化酶在药物代谢中的作用11-12
• 1.2 CYP3A家族简介12-14
• 1.2.1 CYP3A4简介12-14
• 1.3 细胞色素P450氧化酶研究的生物信息学方法14-15
• 1.4 细胞色素P450氧化酶异源表达系统15-17
• 1.4.1 大肠杆菌表达体系15
• 1.4.2 酵母表达体系15-16
• 1.4.3 哺乳动物细胞表达系统16
• 1.4.4 病毒表达体系16-17
• 1.5 T-2 毒素17-19
• 1.5.1 T-2 毒素的性质和结构17-18
• 1.5.2 T-2 毒素代谢转化18
• 1.5.3 T-2 毒素与细胞色素P450氧化酶18-19
• 1.6 本研究的目的、意义及实验总体设计19-20
• 2 材料与方法20-35
• 2.1 材料20-23
• 2.1.1 实验细胞来源20
• 2.1.2 主要仪器设备20-21
• 2.1.3 实验药品21
• 2.1.4 主要试剂21-23
• 2.1.5 生物信息学分析工具23
• 2.2 实验方法23-35
• 2.2.1 CYP3A22原核表达23-25
• 2.2.2 CYP3A22酵母表达25-27
• 2.2.3 蛋白同源比对27-28
• 2.2.4 CYP3A46及其突变体真核表达载体构建28-30
• 2.2.5 细胞培养30-31
• 2.2.6 S9组分提取31-35
• 2.2.7 统计分析35
• 3 实验结果与分析35-49
• 3.1 CYP3A22原核系统表达35-38
• 3.2 CYP3A22酵母系统表达38
• 3.3 CYP3A真核表达38-41
• 3.4 人CYP3A4和猪CYP3A家族蛋白的同源对比41-43
• 3.5 CYP3A22和CYP3A46三维结构模拟模型43
• 3.6 分子对接43-44
• 3.7 CYP3A46与T-2 毒素羟化反应活性位点分析44-45
• 3.7.1 CYP3A46突变载体构建44-45
• 3.8 CYP3A46突变体真核表达45-46
• 3.8.1 CYP3A46真核表达45-46
• 3.9 CYP3A46及其突变体与T-2 毒素代谢差异46-49
• 4 讨论49-53
• 4.1 CYP3A22蛋白的原核表达体系总结49-50
• 4.2 CYP3A家族与T-2 毒素对接结果50-51
• 4.3 CYP3A结构与功能分析51-53
• 5 总结53-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Ni-ni Lin;Jia Chen;Bin Xu;Xia Wei;Lei Guo;Jian-wei Xie;;The roles of carboxylesterase and CYP isozymes on the in vitro metabolism of T-2 toxin[J];Military Medical Research;2015年01期

2 周晓菲;冯晓声;张乃生;周昌芳;冯晓群;;T-2毒素及其对关节软骨和心肌毒性研究进展[J];动物医学进展;2006年12期

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本文编号：516452