猪miR-155两种基因型的性状关联分析的研究

发布时间：2017-07-06 13:11

  本文关键词：猪miR-155两种基因型的性状关联分析的研究

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【摘要】：微小RNA(microRNA)是非编码RNA中最为人们熟悉的一个亚类,它广泛的参与发育,细胞凋亡和细胞增值。miR-155在免疫系统发生发育及调控中扮演重要角色,其宿主基因上关键位点的突变可能导致miR-155表达量的改变,从而引起下游免疫系统的差异。我们根据miR-155宿主基因BIC(B-cell Integration Cluster)上的SNP信息,利用PCR-RFLP方法在中外培育品种猪中鉴定了两种基因型个体,利用流式细胞术分选调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)以进行后续基因表达差异试验验证,同时统计分析了其中一个关键SNP的基因型与杜洛克×二花脸F2资源群体的免疫指标关联性,具体结果如下:(1)不同猪种两种基因型个体的鉴定在miR-155宿主基因BIC上,我们将miR-155前体的第一个碱基以+1表示,上游305bp的A/C突变以-305bp表示,我们根据-305A/C这个SNP信息,在三个中外培育品种中寻找两种基因型个体。通过对55头苏钟猪、300鄂通两头乌和250头湖北白猪进行PCR-RFLP分析,在鄂通两头乌中挑选得到4头AA型个体和3头CC型个体,在湖北白猪中挑选到2头AA型个体和2头CC型个体。在鄂通两头乌群体中,AA基因型频率为0.0348,AC基因型频率为0.4609,CC基因型频率为0.5043。A的基因频率为0.2653,C的基因频率为0.7347。在湖北白猪群体中,AA基因型频率为0.8279,AC基因型频率为0.1680,CC基因型频率为0.0041。A的基因频率为0.9119,C的基因频率为0.0881。在检测的55头苏钟猪中,没有发现CC型。AA基因型频率为0.6545,AC基因型频率为0.3455。A的基因频率为0.8273,C的基因频率为0.1727。(2)两种基因型猪血常规性状差异分析利用Beckman Coulter Ac.Tdiff 2血细胞分析仪对两种基因型的鄂通两头乌进行血常规检测,将4头AA基因型个体和3头CC基因型个体的血液指标进行T检验分析。结果发现:两种基因型猪间,红细胞平均体量(MCV,f L)存在差异(P0.05),红细胞体积分布宽度(RDW,%)存在显著差异(P0.01)。(3)MiR-155上游305A/C突变与F2群体一些免疫指标的关联分析根据miR-155上游305bp的A/C突变对杜洛克×二花脸F2资源群体共计394头个体进行分型,并在不同时间点与该群体的免疫指标进行关联分析。结果表明:在F2群体中,AA基因型频率为0.2507,AC基因型频率为0.5171,CC基因型频率为0.2321。A的基因频率为0.5092,C的基因频率为0.4908。在20日龄时,miR-155前体上游305A/C突变对CD4-CD8+CD3-,CD4-CD8+CD3+细胞有显著影响(P0.05)。在33日龄时,mi R-155前体上游305 A/C变异对红细胞数(RBC)、红细胞比容(HCT)和血红蛋白含量(HGB)有显著影响(p0.05),对血小板体积分布宽度(PDW)和血小板平均体积(MPV)有极显著影响(p0.01)。在35日龄时,该SNP对血红蛋白含量(HGB)、红细胞比容(HCT)有显著影响(p0.05),对血小板体积分布宽度(PDW)有极显著影响(p0.01)。在80日龄时,对嗜酸性粒细胞数(EO),嗜酸性粒细胞比率(EOP)有显著影响(p0.05)。该位点可能影响miR-155的表达,从而在个体生长的不同时间点,调控不同的通路,影响不同类型的免疫细胞的发育。(4)两种基因型猪的Treg细胞分选利用流式细胞仪和三种不同荧光标记的抗体分选不同基因型猪的Treg。先根据总白细胞中不同细胞的物理参数(大小,浓度等)的不同分选出淋巴细胞,设置一个门,再从这个门中分选出CD3+的细胞类群,再从中选取CD4+细胞,最后再从CD4+T细胞中选择CD25+细胞,最终得到Treg细胞,流式细胞分析结果表明猪Treg细胞占总白细胞的1%左右。(5)体外实验验证miR-155对其靶基因的作用通过转染mimic155到猪的巨噬细胞中,发现了miR-155对四种靶基因的mRNA表达水平的影响不显著。本研究初步证明了miR-155宿主基因BIC上的SNP突变与一些免疫指标存在关联。miR-155对其靶基因的作用可能是转录后水平。该研究为揭示两种基因型猪之间的免疫能力差异提供了理论依据,同时为猪相关性状分子育种提供了新的分子标记。
【关键词】：猪 SNP 免疫指标 Treg miR-155 靶基因
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 缩略词表（ABBREVIATIONS）11-12
• 1 前言12-21
• 1.1 研究问题的由来12-13
• 1.2 MicroRNA在免疫系统中的作用13-16
• 1.2.1 MicroRNA研究现状13
• 1.2.2 MicroRNA对免疫细胞发育的作用13-15
• 1.2.3 MicroRNA调节免疫系统的信号通路15
• 1.2.4 MicroRNA点突变在免疫中的研究进展15-16
• 1.3 MiR-155与免疫的关系16-18
• 1.3.1 MiR-155对免疫系统的作用16-17
• 1.3.2 MiR-155靶基因的研究进展17-18
• 1.4 调节性T细胞的研究进展18-20
• 1.4.1 调节性T细胞的免疫功能18-19
• 1.4.2 转录因子Foxp3的研究进展19
• 1.4.3 Foxp3直接靶向miR-155调节Treg19-20
• 1.5 研究的目的与意义20-21
• 2 技术路线、材料及方法21-27
• 2.1 技术路线21
• 2.2 材料21-23
• 2.2.1 试验动物群体21-22
• 2.2.2 细胞系22
• 2.2.3 主要试验试剂22
• 2.2.4 主要生化试剂的配置22-23
• 2.2.5 主要数据库和生物学软件23
• 2.3 方法23-27
• 2.3.1 SNP关联分析23-24
• 2.3.2 两种基因型个体血常规检测24-25
• 2.3.3 流式细胞仪分选猪Treg25
• 2.3.4 细胞培养25-26
• 2.3.5 细胞转染试验26
• 2.3.6 数据统计方法，，所用统计软件及统计模型26-27
• 3 结果与分析27-42
• 3.1 两种基因型个体差异的研究27-33
• 3.1.1 A/C两种基因型个体鉴定27-29
• 3.1.2 两种基因型猪血常规T检验分析29-31
• 3.1.3 流式细胞仪分选两种基因型猪的调节性T细胞31-33
• 3.2 miR-155的研究33-42
• 3.2.1 miR-155前体上游 305bp SNP与免疫性状的关联分析33-40
• 3.2.2 mimic155转染细胞后靶基因表达量的探究40-42
• 4 讨论42-47
• 4.1 关于三种中外培育品种猪基因型频率的讨论42
• 4.2 关于miR-155结构与功能的讨论42-45
• 4.2.1 miR-155调节造血进程与AA/CC基因型血常规差异讨论42-43
• 4.2.2 miR-155调节免疫细胞发育及关联分析结果讨论43-44
• 4.2.3 关于mimic155转染细胞后靶基因表达量差异的讨论44-45
• 4.3 关于Treg分选的讨论45
• 4.3.1 关于Treg分选结果的讨论45
• 4.4 关于下一步工作的计划45-47
• 5 小结47-49
• 5.1 本研究的主要结果47
• 5.2 本研究的创新点与特色47-48
• 5.3 本研究的不足之处以及有待解决的问题48-49
• 参考文献49-57
• 致谢57-58

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本文编号：526349