甘氨酰tRNA合成酶调节奶牛乳腺上皮细胞NFκB1信号通路研究

发布时间：2017-07-07 22:18

  本文关键词：甘氨酰tRNA合成酶调节奶牛乳腺上皮细胞NFκB1信号通路研究

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【摘要】：本实验室前期试验表明,奶牛乳腺上皮细胞中,甘氨酰tRNA合成酶(Gly RS)能接受氨基酸信号,在544位苏氨酸(threonine,T544)和704位丝氨酸(serine,S704)处磷酸化,进入细胞核,调节乳蛋白合成,而其调节机制尚未发现。本试验旨在揭示GlyRS调控乳蛋白合成的详细分子机理。通过添加0.6mmol/L的蛋氨酸(methionine,Met),建立Met促进β-酪蛋白(β-casein,CSN2)合成表达的泌乳模型。检测此泌乳模型中,NFκB1和p-NFκB1的表达与亚细胞定位。检测发现NFκB1在胞浆有分子质量141k Da和105k Da两种形式,而在胞核只有105k Da形式;NFκB1进入细胞核后存在分子剪切,剩下N端部分为p-NFκB1,分子质量约为50k Da。细胞在Met促进作用下,NFκB1表达水平有所上升,而且p-NFκB1在胞核内定位显著升高。结果提示Met通过促进胞浆中NFκB1同IκBα解离进入细胞核,并发生磷酸化,从而调控乳合成相关基因的转录表达。研究不同氨基酸处理对p-GlyRS的表达影响,结果表明添加蛋氨酸、亮氨酸和赖氨酸均能使细胞中p-GlyRS、GlyRS和CSN2的表达显著上升;在亚细胞定位中发现,GlyRS只存在于胞浆中,而p-GlyRS(T544)和p-GlyRS(S704)在胞浆中均为80kDa形式,在胞核中均为70kDa形式。添加氨基酸之后p-GlyRS在胞核中70k Da形式的定位明显增加。数据表明,氨基酸刺激GlyRS磷酸化,并快速移入核中,被剪切成截短的形式。本研究采用免疫共沉淀(Co-IP)技术鉴定了细胞中NFκB1与GlyRS不结合,而与p-GlyRS(T544)和p-GlyRS(S704)在胞核中结合。为研究p-GlyRS是否通过GCN2/e IF2α途径影响NFκB1基因表达,对GlyRS进行过表达与干扰实验,Western blotting检测细胞中NFκB1、e IF2α、GCN2的表达情况和磷酸化水平。结果表明,氨基酸刺激GlyRS磷酸化入核,抑制GCN2磷酸化,并调节NFκB1的转录激活,从而促进乳蛋白的合成。本研究采用放线菌酮抑制总蛋白合成,观察在Met信号刺激下,GlyRS、NFκB1、mTOR和Stat5的表达情况和磷酸化水平。结果显示,放线菌酮使各蛋白的表达水平降低,添加Met使各蛋白表达水平有所增加。提示GlyRS感应氨基酸信号并不依赖于蛋白质翻译过程。本研究继续验证GlyRS磷酸化是否依赖于mTOR途径。用雷帕霉素抑制mTOR活性,Western blotting检测细胞中NFκB1、GlyRS、mTOR及其磷酸化的表达情况。结果显示,在雷帕霉素抑制作用下额外添加Met,细胞中GlyRS、p-GlyRS、NFκB1和p-NFκB1表达水平均显著升高。表明雷帕霉素没有抑制Met信号下GlyRS和NFκB1的磷酸化,说明GlyRS的磷酸化作用不依赖于mTOR途径,即m TOR不是GlyRS的上游激酶。综上所述,氨基酸的促进作用,使GlyRS在T544和S704处磷酸化,进入细胞核,被剪切成了截短的形式,抑制GCN2磷酸化,并与NFκB1结合,使NFκB1磷酸化并与下游靶基因的增强子位点结合,从而启动靶基因的转录和表达。
【关键词】：甘氨酰t RNA合成酶 NFκB1 磷酸化 奶牛乳腺上皮细胞 蛋氨酸
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 1 前言14-23
• 1.1 奶牛乳腺发育与泌乳14
• 1.2 奶牛乳蛋白合成机理14-15
• 1.3 奶牛乳蛋白合成信号转导途径研究15-17
• 1.3.1 JAK2-STAT5信号通路15-16
• 1.3.2 mTOR信号通路16-17
• 1.4 氨基酸对泌乳的调节作用17
• 1.5 NF-κB相关研究17-19
• 1.5.1 NF-κB的分类17-18
• 1.5.2 NF-κB的功能研究18-19
• 1.6 氨酰t RNA合成酶的功能研究19-21
• 1.6.1 氨酰tRNA合成酶的结构与功能19-20
• 1.6.2 甘氨酰t RNA合成酶相关研究20-21
• 1.7 GCN2/e IF2α 途径相关研究21
• 1.7.1 e IF2α 相关研究21
• 1.7.2 GCN2相关研究21
• 1.8 实验目的与意义21-23
• 2 材料与方法23-40
• 2.1 实验材料23-28
• 2.1.1 主要实验试剂23-24
• 2.1.2 主要实验仪器24
• 2.1.3 实验动物与细胞24
• 2.1.4 主要溶液的配制24-28
• 2.2 奶牛乳腺上皮细胞的培养纯化与鉴定28-31
• 2.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养与纯化28-29
• 2.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定29-31
• 2.2.3 奶牛乳腺上皮细胞的冻存31
• 2.3 添加蛋氨酸的奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立31-32
• 2.4 添加蛋氨酸后乳腺上皮细胞中NFκB1和p-NFκB1的表达与亚细胞定位32
• 2.4.1 IF法检测添加蛋氨酸后细胞中NFκB1和p-NFκB1的表达与亚细胞定位32
• 2.4.2 WB法检测添加蛋氨酸后细胞中NFκB1和p-NFκB1的表达与亚细胞定位32
• 2.5 不同氨基酸处理对磷酸化GlyRS蛋白表达水平上的影响32-33
• 2.5.1 不同氨基酸处理对磷酸化GlyRS总蛋白表达水平上的影响32-33
• 2.5.2 不同氨基酸对磷酸化GlyRS胞浆和胞核蛋白水平上的影响33
• 2.6 免疫共沉淀分析NFκB1与GlyRS的相互作用33-34
• 2.6.1 胞浆蛋白和胞核蛋白的提取与纯度鉴定33
• 2.6.2 免疫共沉淀分析NFκB1与GlyRS的相互作用33-34
• 2.7 p-GlyRS与GCN2/e IF2α 途径的关系研究34-38
• 2.7.1 GlyRS过表达对GCN2/e IF2α 途径的影响34-37
• 2.7.2 GlyRS抑制对GCN2/e IF2α 途径的影响37-38
• 2.8 蛋白质翻译过程和mTOR途径对GlyRS磷酸化的影响38
• 2.8.1 蛋白质翻译过程对GlyRS磷酸化的影响38
• 2.8.2 mTOR途径对GlyRS磷酸化的影响38
• 2.9 统计分析38-40
• 3 结果与分析40-57
• 3.1 乳腺上皮细胞的原代培养、纯化及其鉴定40-41
• 3.1.1 乳腺上皮细胞的原代培养、纯化40-41
• 3.1.2 乳腺上皮细胞的鉴定41
• 3.2 添加蛋氨酸的奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立41-42
• 3.3 添加蛋氨酸后乳腺上皮细胞中NFκB1和p-NFκB1的表达与亚细胞定位42-46
• 3.3.1 IF检测添加蛋氨酸后细胞中NFκB1和p-NFκB1的表达与定位42-44
• 3.3.2 WB检测添加蛋氨酸后细胞中NFκB1和p-NFκB1的表达与定位44-46
• 3.4 氨基酸处理对乳腺上皮细胞中磷酸化GlyRS的影响46-48
• 3.4.1 总蛋白水平上氨基酸处理对磷酸化GlyRS的影响46-47
• 3.4.2 胞浆和胞核蛋白水平上不同氨基酸对磷酸化GlyRS的影响47-48
• 3.5 NFκB1与GlyRS相互作用48-49
• 3.5.1 胞浆和胞核的提取与纯度鉴定48
• 3.5.2 NFκB1与GlyRS相互作用验证48-49
• 3.6 p-GlyRS与GCN2/e IF2α 途径的关系研究49-55
• 3.6.1 GlyRS过表达对GCN2/e IF2α 途径的影响49-53
• 3.6.2 GlyRS抑制对对GCN2/e IF2α 途径的影响53-55
• 3.7 蛋白质翻译过程和mTOR途径对GlyRS磷酸化的影响55-57
• 3.7.1 蛋白质翻译过程对GlyRS磷酸化的影响55
• 3.7.2 mTOR途径对GlyRS磷酸化的影响55-57
• 4 讨论57-60
• 4.1 奶牛乳腺上皮细胞添加蛋氨酸泌乳模型中NFκB1的表达与亚细胞定位57
• 4.2 添加氨基酸对奶牛乳腺上皮细胞中p-GlyRS的影响57-58
• 4.3 p-GlyRS与GCN2/eIF2α 途径的关系58
• 4.4 蛋白质翻译和mTOR途径对GlyRS磷酸化的影响58-60
• 5 结论60-61
• 致谢61-62
• 参考文献62-70
• 附录70-71
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文71

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本文编号：532064