饲料添加剂共轭亚油酸生物合成研究

发布时间：2017-07-08 01:18

  本文关键词：饲料添加剂共轭亚油酸生物合成研究

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【摘要】：共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid,CLA)是一种人体自身无法合成但是具有重要的保健作用和营养价值的一种脂肪酸,近年来利用实验动物对其生理功能做了广泛的研究,包括抗肿瘤、减肥、提高免疫力等生理功能。CLA也是非常有应用前景的饲料添加剂,能够增加动物肌肉组织,减少脂肪含量；生产富含CLA的动物产品如牛奶、禽蛋等；提高动物免疫力,减少抗生素的使用。自然界存在的共轭亚油酸只在反刍动物肉、奶、及其制品中找到,且含量有限。化学生产方法产物不单一,而且混有副产物。因此本实验希望通过生物方法得到一种生物酶,可以在适宜的条件下催化富含亚油酸的红花籽油得到共轭亚油酸,为大规模生产CLA用于饲料添加剂提供基础。本研究共分为以下三个部分：共轭亚油酸检测方法建立。一是分光光度计法,利用共轭亚油酸的共轭双键在233nm下有吸收值,而亚油酸没有；另一种是气相色谱(气质联用)法,根据脂肪酸链的长度和不饱和度进行分离。菌株的构建和发酵条件探索；通过查找蛋白晶体结构,找到了一种来源于痤疮丙酸杆菌的可以生产单一共轭亚油酸(trans-10,cis-12 CLA)的亚油酸异构酶,酶基因由上海捷瑞公司合成,选用大肠杆菌作为转化子,通过构建载体和转化体,获得了一种可以生产单一结构的共轭亚油酸的大肠杆菌。通过亚油酸异构酶的发酵条件研究,确定了发酵底物浓度为1%o LA和1‰辅酶FAD。最适反应温度在40℃左右,pH6.7左右,在此条件下亚油酸异构酶保持最高的活性；双酶联用催化体系的建立和细胞的固定化：以红花籽油作为底物,8种候选脂肪酶与实验二获得的亚油酸异构酶建立双酶联用体系,以共轭亚油酸产率为选择指标,选出2种理想的脂肪酶用于后续反应。通过固定化表达亚油酸异构酶重组细胞,固定化细胞的重复次数达到9次以上,共轭亚油酸的产率达到39%以上,产物的纯度达到99%以上,该技术具有工业应用的前景。
【关键词】：共轭亚油酸CLA 亚油酸异构酶PAI 固定化 双酶联用
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S816.7
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第一章 文献综述11-18
• 1.1 共轭亚油酸主要生理功能11-12
• 1.2 国内外共轭亚油酸种来源的研究现状12-14
• 1.2.1 共轭亚油酸天然食物来源12
• 1.2.2 化学法制备共轭亚油酸12
• 1.2.3 CLA的生物合成12-14
• 1.3 脂肪酶与亚油酸异构酶双酶体系生产CLA14-15
• 1.4 固定化酶和固定化细胞15-16
• 1.5 本课题的研究内容16-18
• 第二章 CLA检测方法建立18-24
• 2.0 前言18
• 2.1 实验材料和仪器18-19
• 2.1.1 试剂及器材18-19
• 2.2 实验方法19-20
• 2.2.1 分光光度计检测法检测19
• 2.2.2 GC-MS法检测19-20
• 2.3 实验结果20-23
• 2.3.1 分光光度计法检测20
• 2.3.2 GC-MS法检测20-23
• 2.4 本章小结23-24
• 第三章 共轭亚油酸的原核表达系统的构建24-38
• 3.1 引言24-25
• 3.2 实验材料及仪器25-27
• 3.2.1 基因和菌种25
• 3.2.2 试剂及器材25-26
• 3.2.3 溶液与培养基26-27
• 3.3 实验方法27-30
• 3.3.1 共轭亚油酸异构酶基因的获得27
• 3.3.2 构建工程菌27
• 3.3.3 优化重组酶表达的诱导条件27-28
• 3.3.4 Ni+柱纯化初步纯化重组蛋白28
• 3.3.5 重组酶反应最适温度的探索28-29
• 3.3.6 重组酶反应最适pH的探索29
• 3.3.7 在最适反应条件下检测重组酶的转化率和产率29-30
• 3.4 结果与讨论30-36
• 3.4.1 优化重组酶表达的诱导条件30-31
• 3.4.2 Ni+柱纯化初步纯化重组蛋白31-32
• 3.4.3 重组酶反应最适温度的探索32-33
• 3.4.4 重组酶反应最适pH的探索33-34
• 3.4.5 在最适反应条件下检测重组酶的转化率和产率34-36
• 3.5 本章小结36-38
• 第四章 共轭亚油酸的酶法合成工艺研究38-49
• 4.1 引言38-39
• 4.2 实验材料与仪器39-40
• 4.2.1 菌种39
• 4.2.2 试剂及器材39-40
• 4.2.3 溶液与培养基40
• 4.3 实验方法40-43
• 4.3.1 重组PAI酶液制备40
• 4.3.2 脂肪酶酶活的测定方法40-41
• 4.3.3 脂肪酶CAL-B和共轭亚油酸异构酶PAI的共表达41
• 4.3.4 筛选脂肪酶,优化反应体系41-42
• 4.3.5 固定化PAI酶42-43
• 4.3.6 固定化PAI细胞43
• 4.3.7 双酶联用体系生产共轭亚油酸43
• 4.4 结果与讨论43-48
• 4.4.1 共表达菌株酶活力的检测43-45
• 4.4.2 筛选脂肪酶45-46
• 4.4.3 固定化PAI酶46-47
• 4.4.4 固定化细胞47-48
• 4.4.5 双酶联用体系生产共轭亚油酸48
• 4.5 本章小结48-49
• 第五章 结论与展望49-50
• 5.1 结论49
• 5.2 展望49-50
• 参考文献50-55

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