华南部分地区PRRSV流行病学调查及Nsp1α和Nsp1β的原核表达

发布时间：2017-07-08 01:11

  本文关键词：华南部分地区PRRSV流行病学调查及Nsp1α和Nsp1β的原核表达

  更多相关文章： 猪繁殖与呼吸综合征 ORF5 Nsp2 非结构蛋白 原核表达

【摘要】：为了了解华南地区PRRSV的遗传变异情况及抗体水平,本实验对2014-2015年间收集的华南部分地区的猪血清和病料分别进行PRRSV抗体和抗原的检测,检测结果表明:2014共采集5046份猪血清,其中PRRSV抗体阳性血清为4195份,阳性率为83.13%(4195/5046);95%置信区间为82.67%-83.59%;2015年共采集5531份血清,经检测PRRSV阳性血清共3992份,阳性率为72.18%(3992/5531),95%置信区间为70.38%-72.4%;2014年共采集病料583份,其中PRRSV检测为阳性的样本为192份,阳性率为33.01%(192/583),95%置信区间为32.78%-33.23%;2015年共采集病料964份,PRRSV检测阳性的样本数为356,阳性率为36.88%(356/964),95%置信区间为36.56%-37.2%,与2014年比较,2015年检测的PRRSV抗体阳性率有所下降而抗原的阳性率有所上升。研究又对PRRSV阳性样本进行Nsp2和GP5基因的扩增,成功地获得31条Nsp2序列和64个GP5序列,分析比对Nsp2和GP5基因的氨基酸序列后发现:其中26株PRRSV的Nsp2基因依然是29+1个氨基酸缺失,但也存在着其他形式的氨基酸位点的缺失。与参考毒株相比,GP5基因存在着广泛的氨基酸位点的突变,主要的突变区域为信号肽区、第一高变区以及第二高变区。GP5的遗传进化树结果表明:华南地区同时存在着欧洲型和北美型PRRSV,北美型PRRSV进一步分为6个亚群,华南地区主要流行的亚群是以JXA1为代表的Subgenotype I亚群和以GM2为代表的Subgenotype VI亚群,近几年新出现的NADC30-like亚群毒株在华南地区也有出现。分离、鉴定了10株PRRSV,10株PRRSV相互之间的核苷酸同源性为92.6%-97.5%,与JXA1、VR2332及CH-1R毒株的核苷酸同源性分别为95.3%-98.9%、87.8%-89.15%、91.5%-94.9%。基于全基因组的遗传进化树结果显示10株PRRSV除FJXM毒株属于过渡亚群Intermediate subgroup外,其余均属于以JXA1为代表的JXA1-like亚群,彼此之间的亲缘关系较为密切。与参考毒株相比,部分毒株的GP3、GP5、GP6蛋白的抗原位点发生了氨基酸位点的突变。研究还对PRRSV的Nsp1α及Nsp1β基因进行扩增,将其连接到pET-28a表达载体后转化BL21感受态,经Western blot验证Nsp1α及Nsp1β蛋白得到了成功表达。为后续研究Nsp1α及Nsp1β蛋白的功能奠定了基础。
【关键词】：猪繁殖与呼吸综合征 ORF5 Nsp2 非结构蛋白 原核表达
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文缩写对照表6-11
• 1 前言11-20
• 1.1 PRRSV病原学11-15
• 1.1.1 PRRSV的分类地位及基因组结构11
• 1.1.2 PRRSV的形态结构及理化性质11-12
• 1.1.3 PRRSV的结构和非结构蛋白12-14
• 1.1.4 PRRSV的非结构蛋白14-15
• 1.1.5 PRRSV的基因分型15
• 1.2 PRRSV的流行病学特征15-17
• 1.2.1 PRRSV的宿主及临床症状15-16
• 1.2.2 PRRSV的病理变化16
• 1.2.3 PRRSV的传播途径16
• 1.2.4 PRRSV的疫苗与防控措施16-17
• 1.3 PRRSV的遗传变异17-18
• 1.3.1 RNA病毒的复制特性17
• 1.3.2 准种现象17-18
• 1.3.3 基因重组18
• 1.4 本研究的目的与意义18-20
• 2 材料与方法20-34
• 2.1 病毒、菌株、载体及细胞20
• 2.2 细胞培养相关试剂20
• 2.3 工具酶、试剂盒及主要的分子生物学试剂20-21
• 2.4 检测样品21
• 2.5 仪器设备21
• 2.6 PRRSV血清抗体的检测21-22
• 2.7 引物的设计与合成22-23
• 2.8 样品的RT-PCR检测23-27
• 2.8.1 总RNA的提取23-24
• 2.8.2 cDNA的合成24
• 2.8.3 PCR扩增24-25
• 2.8.4 PCR回收产物与载体连接25
• 2.8.5 感受态细胞的制备25
• 2.8.6 连接产物转化感受态细胞25
• 2.8.7 PCR鉴定阳性菌液25
• 2.8.8 ORF5及部分Nsp2基因测序结果分析25-27
• 2.9 病毒的分离与鉴定27-29
• 2.9.1 病毒的分离27
• 2.9.2 分离病毒的PCR鉴定27
• 2.9.3 分离病毒的间接免疫荧光鉴定27-28
• 2.9.4 分离病毒的全基因组测序28
• 2.9.5 分离病毒的全基因组序列分析28-29
• 2.10 PRRSV Nsp1α及Nsp1β的原核表达29-34
• 2.10.1 Nsp1α及Nsp1β的扩增29
• 2.10.2 PCR扩增产物的纯化29
• 2.10.3 目的片段与载体的双酶切29-30
• 2.10.4 目的片段与载体的连接30
• 2.10.5 大肠杆菌感受态细胞的制备30
• 2.10.6 重组质粒的转化30
• 2.10.7 重组质粒的抽提30-31
• 2.10.8 重组质粒的酶切鉴定31
• 2.10.9 重组质粒序列的测定31
• 2.10.10 重组质粒转化感受态细胞31
• 2.10.11 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析31
• 2.10.12 重组蛋白SDS-PAGE鉴定31-32
• 2.10.13 重组蛋白最佳诱导时间的确定32
• 2.10.14 重组蛋白最佳IPTG诱导浓度的确定32
• 2.10.15 重组蛋白Western-Blot鉴定32-34
• 3 结果34-53
• 3.1 2014-2015年华南部分地区PRRSV抗体检测结果34
• 3.2 2014-2015年华南部分地区PRRSV抗原检测结果34-35
• 3.3 2014-2015年部分Nsp2基因氨基酸比对分析35-36
• 3.4 2014-2015年GP5基因遗传进化分析36-38
• 3.5 2014-2015年GP5基因氨基酸同源性分析38
• 3.6 2014-2015年GP5基因氨基酸突变位点分析38-41
• 3.7 欧洲型PRRSV GP5遗传进化及突变分析41-42
• 3.8 病毒的分离鉴定42
• 3.9 PRRSV全基因组的扩增42-43
• 3.10 PRRSV全基因组的遗传进化分析43-45
• 3.11 分离毒株全基因组的同源性分析45-47
• 3.12 分离毒株Nsp2及GP3/GP5/GP6基因氨基酸突变位点分析47-48
• 3.13 分离毒株Nsp9/Nsp10基因氨基酸突变位点分析48
• 3.14 Nsp1α及Nsp1β的扩增48-49
• 3.15 重组质粒的酶切鉴定49
• 3.16 重组质粒的表达与可溶性分析49-50
• 3.17 重组蛋白的最佳诱导时间的确定50-51
• 3.18 重组蛋白的最佳IPTG诱导浓度的确定51-52
• 3.19 重组蛋白Western-blot鉴定52-53
• 4 讨论53-56
• 4.1 2014-2015年华南部分地区PRRSV抗体和抗原的检测53
• 4.2 Nsp2和GP5基因遗传进化与变异分析53-54
• 4.3 PRRSV的分离鉴定及全基因组序列分析54-55
• 4.4 PRRSV Nsp1α和Nsp1β的原核表达55-56
• 5 全文总结56-57
• 致谢57-58
• 参考文献58-70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李冰;刘丽颖;王辉暖;周铁忠;;欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪病理学特征及其组织内病毒分布[J];动物医学进展;2015年07期

2 Yuhang Cao;Hongsheng Ouyang;Mingjun Zhang;Fuwang Chen;Xin Yang;Daxing Pang;Linzhu Ren;;Analysis of molecular variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China between 2007 and 2012[J];Virologica Sinica;2014年03期

3 Richard Y. ZHAO,Robert T. ELDER;Viral infections and cell cycle G2/M regulation[J];Cell Research;2005年03期

，

本文编号：532513