家蝇AS61、AS566和DefensinⅠ基因的表达及产物抑菌活性分析

发布时间：2017-07-08 09:15

  本文关键词：家蝇AS61、AS566和DefensinⅠ基因的表达及产物抑菌活性分析

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【摘要】：近年来,抗生素在临床诊治上的不合理使用导致细菌的耐药性问题越发严峻,严重影响了人类以及动物的健康,因此,研发不易使致病菌产生耐药性并且可代替抗生素的新型药剂是目前急需解决的问题。家蝇(Musca domestica)通常生活在阴暗潮湿、杂菌丛生的环境中,但因其具有独特的防御体系而极少受到病原菌侵染。家蝇抗菌蛋白及抗菌肽作为家蝇防御体系中的重要成分,对多种病原菌均具有抗菌活性,且因其具有不易产生耐药性和对人畜均无毒副作用等优点,已受到了国内外科研工作者的广泛关注。本研究以鸡源致病性大肠杆菌以及鸡源沙门氏菌诱导家蝇三日龄幼虫构建抑制性消减文库中所筛选到的差异基因为基础,以5'-RACE-Ready cDNA为模板,利用PCR(聚合酶链式反应)技术对一个未知功能基因AS61进行全长扩增,对其核酸序列及蛋白质序列进行生物信息学分析,构建重组表达质粒pET-32a-AS61,进行原核表达并对其表达产物进行体外抑菌活性检测。以课题组成功扩增出的家蝇抗菌蛋白AS566、家蝇防御素基因DefensinⅠ为基础,成功构建重组表达质粒pGAPZαA-AS566和pGAPZαA-DefensinⅠ,并进行真核表达,对其表达产物分别进行体外抑菌活性检测。主要实验结果如下:1、成功扩增出AS61基因全长序列,其ORF序列长度为537 bp。AS61生物信息学分析结果:AS61基因编码179个氨基酸,其理论等电点为7.61,呈疏水性,不存在跨膜区,含信号肽,二级结构含有α 螺旋、不规则盘绕和延伸链,存在少量β 折叠。2、成功构建重组表达质粒pET-32a-AS61并在大肠杆菌中获得表达,诱导表达条件:IPTG浓度为0.4 mM,诱导时间为4 h。AS61表达产物为融合蛋白,大量存在于裂解液上清中。成功构建重组表达质粒pGAPZαA-AS566、pGAPZαA-DefensinⅠ并在毕赤酵母中分泌表达,表达产物分泌于上清液中,最佳表达时间为72 h。3、原核表达产物纯化及浓缩后经体外抑菌实验检测,AS61对大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌均无明显抑制作用。真核表达产物浓缩后经体外抗菌实验表明,AS566对鸡源沙门氏菌及猪源金黄色葡萄球菌均具有明显抑制作用,对鸡致病性大肠杆菌无明显抑制作用;DefensinⅠ对大肠杆菌具有较弱的抑制作用,对沙门氏菌及金黄色葡萄球菌均无明显抑制作用。以上实验结果为进一步研究这三种家蝇幼虫基因的作用机制奠定了基础,并为新型抗菌药物的研发提供理论依据。
【关键词】：抗菌肽 融合蛋白 分泌表达 抑菌活性
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.79
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 前言7-8
• 第一篇 文献综述8-14
• 第一章 家蝇抗菌肽的研究进展8-14
• 1.1 家蝇抗菌肽的分类及结构特征8-9
• 1.2 家蝇抗菌肽的抗菌机制9-10
• 1.3 家蝇抗菌肽编码基因的原核表达10-11
• 1.4 家蝇抗菌肽基因的真核表达11-12
• 1.5 家蝇抗菌肽的生物活性12
• 1.6 家蝇抗菌肽的应用前景12-14
• 第二篇 研究内容14-50
• 第一章 家蝇幼虫差异基因的克隆及生物学分析14-29
• 1.1 实验材料14-15
• 1.2 实验方法15-21
• 1.3 结果与分析21-28
• 1.4 讨论28
• 1.5 小结28-29
• 第二章 未知功能基因AS61的原核表达及抗菌蛋白AS566、防御素基因DefensinⅠ的真核表达29-43
• 2.1 实验材料29-30
• 2.2 实验方法30-36
• 2.3 实验结果36-41
• 2.4 讨论41-42
• 2.5 小结42-43
• 第三章 表达产物的纯化、浓缩及抑菌活性的鉴定43-50
• 3.1 实验材料43-44
• 3.2 实验方法44-45
• 3.3 实验结果45-47
• 3.4 讨论47-48
• 3.5 小结48-50
• 结论50-51
• 参考文献51-55
• 作者简介55-56
• 致谢56

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1 闫恕;家蝇AS61、AS566和DefensinⅠ基因的表达及产物抑菌活性分析[D];吉林农业大学;2016年

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本文编号：533889