GABRP对水牛乳腺上皮细胞增殖以及泌乳相关基因表达的影响

发布时间：2017-07-13 23:27

  本文关键词：GABRP对水牛乳腺上皮细胞增殖以及泌乳相关基因表达的影响

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【摘要】：γ-氨基丁酸是大脑中抑制性递质的一种重要成分,在神经信号传递中起着重要作用。除脑组织外,丫-氨基丁酸及其受体还存在于多种外周组织中。γ-氨基丁酸的受体有A、B、C三种类型,其中A、C属于门控C1-通道,B型受体是代谢型受体,属于G蛋白偶联家族。兀亚基(GABRP)是发现的一种新型的A型受体亚基。目前对GABRP在癌组织中研究较多,发现它能调节肿瘤细胞的增殖和迁移,但有关其在外周内分泌组织中的作用研究较少。在乳腺组织中,GABRP主要与乳腺癌细胞的迁移有关,几乎没有与乳腺上皮细胞增殖分化方面的研究。课题组前期研究发现,GABRP基因是Stat5a下游的一个靶基因,GABRP基因的表达在小鼠妊娠后期显著升高,推测尢亚基在乳腺发育以及泌乳方面发挥着重要的作用。本课题通过研究GABRP基因对水牛乳腺上皮细胞增殖以及泌乳相关基因表达的影响,在细胞水平上初步了解π亚基的功能,研究结果为进一步了解水牛乳腺细胞的生长规律及泌乳机制奠定基础。1.水牛GABRP基因的克隆及其在乳腺组织中的表达分析。以GenBank数据库中牛的GABRP (NM_001015618.1)为参考序列设计合成特异性扩增引物,以水牛乳腺组织总RNA为模板,应用RT-PC R技术扩增水牛GABRP基因的cDNA序列,结果显示,获得的片段与河流型水牛GABRP基因序列的同源性为99.4%,说明克隆得到了水牛的GABRP基因；应用QRT-PCR技术检测不同时期水牛乳腺组织GABRP基因的表达,结果显示,GABRP基因在泌乳期和非泌乳期乳腺组织中都有表达,且非泌乳期的表达量要显著高于泌乳期(P0.05)；应用免疫组化技术对GABRP蛋白在泌乳期水牛乳腺组织进行定位分析,结果显示,GABRP蛋白主要在乳腺组织的腺泡上皮中表达。2.水牛乳腺上皮细胞的分离纯化鉴定。从屠宰场取回新鲜的泌乳期水牛乳腺组织,利用组织块贴壁法和胰蛋白酶消化差异法分离纯化水牛乳腺上皮细胞,并用免疫荧光染色技术鉴定乳腺上皮细胞特异性骨架蛋白—角蛋白18。结果发现,组织块贴壁法可分离得到乳腺上皮细胞,纯化的乳腺上皮细胞表达角蛋白18,并且具有正常的增殖能力。3.不同浓度GABA、GAB A A受体激动剂muscimol处理对水牛乳腺上皮增殖和泌乳相关基因表达的影响。在水牛乳腺上皮细胞培养液中分别加入50μm/L、100μm/L,500μm/L的GABA,0.5μm/L、5μm/L、50μm/L的muscimol, CCK8试剂盒检测乳腺上皮细胞的增殖情况；流式细胞仪检测不同浓度GABA和muscimol处理对水牛乳腺上皮细胞周期的影响对水牛乳腺上皮细胞周期的影响；QRT-PCR技术检测添加GABA和muscimol对细胞周期蛋白Cyclin1、GABRP 以及 mTOR, FABP3、GLUT等泌乳相关基因表达的影响。结果发现,GABA、muscim ol能显著抑制水牛乳腺上皮细胞的增殖(P0.05),且抑制效率与GABA、muscimol的浓度及处理时间有关。不同浓度的GABA和muscimol处理均能增加G1期细胞比例,降低S、G2期细胞的比例；不同浓度GABA和muscimol处理均能能显著降低CyclinDl和GABRP基因的表达量(P0.05),对mTOR、 FABP3、GLUT1等泌乳过程中的关键基因的表达量有不同程度的影响(P0.05)。以上结果表明,GABA通过GABAA受体的π亚基(GABRP)参与了乳腺发育及泌乳调控过程。
【关键词】：γ-氨基丁酸 GABRP 乳腺上皮细胞 泌乳
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823.83
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 综述部分14-26
• 第一章 GABA及GABA受体的研究进展15-22
• 1 GABAA受体简介15
• 2 GABAB受体简介15-16
• 3 GABAC受体的简介16
• 4 GABA与动物生殖生理16-19
• 4.1 GABA对孕酮分泌的影响16-17
• 4.2 GABA对LH分泌的影响17
• 4.3 GABA对PRL分泌的影响17-18
• 4.4 GABA对生长激素分泌的影响18
• 4.5 GABA对胰岛素分泌的影响18
• 4.6 GABA对精子受精的影响18
• 4.7 GABA对胎盘形成的影响18-19
• 5 GABA与细胞增殖19-20
• 5.1 GABA与非肿瘤细胞的增殖19
• 5.2 GABA与肿瘤细胞的增殖19-20
• 6 生殖系统中的A受体π亚基20-22
• 6.1 GABRP亚基的结构20
• 6.2 GABRP亚基的功能20-22
• 第二章 体外乳腺上皮细胞培养方法的研究进展22-26
• 1 简介22
• 2 乳腺组织的选取22
• 3 乳腺上皮细胞的培养方法22-24
• 3.1 组织块培养法22-23
• 3.2 酶消化法23
• 3.3 机械破碎法23-24
• 3.4 乳汁分离法24
• 4 体外各种因子对乳腺上皮细胞培养的影响24-25
• 研究来源、目的及意义25-26
• 试验部分26-66
• 第三章 GABRP基因的克隆及在乳腺组织中的表达26-43
• 前言26
• 1 材料与方法26-36
• 1.1 GABRP基因的克隆以及其在水牛乳腺组织中的表达(QRT-PCR)26-33
• 1.2 免疫组化检测GABRP蛋白在水牛乳腺组织中的表达33-36
• 2 结果36-41
• 2.1 水牛GABRP基因克隆及鉴定36-38
• 2.2 水牛GABRP序列分析38
• 2.3 水牛GABRP系统进化树构建38-39
• 2.4 不同时期水牛乳腺组织中GABRP基因的表达分析39-40
• 2.5 GABRP蛋白在泌乳期水牛乳腺组织中的表达40-41
• 3 分析与讨论41-42
• 4 小结42-43
• 第四章 水牛乳腺上皮细胞的分离培养43-52
• 前言43
• 1 材料与方法43-47
• 1.1 材料43
• 1.2 主要试剂43-44
• 1.3 主要仪器设备44
• 1.4 主要溶液配制44-45
• 1.5 实验方法45-47
• 2 实验结果47-50
• 2.1 水牛乳腺上皮细胞的分离纯化47-48
• 2.2 第3代水牛乳腺上皮细胞的生长曲线48
• 2.3 免疫荧光染色法鉴定水牛乳腺上皮细胞角蛋白18的表达48-50
• 3 分析与讨论50-51
• 4 小结51-52
• 第五章 不同浓度GABA、GABA A受体激动剂muscimol对乳腺上皮增殖和泌乳相关基因表达的影响52-66
• 前言52
• 1 材料与方法52-55
• 1.1 主要试剂52
• 1.2 主要仪器52-53
• 1.3 不同浓度GABA、GABA A受体激动剂Muscimol对乳腺上皮增殖的影响53
• 1.4 流式细胞仪检测细胞周期53-54
• 1.5 不同浓度GABA、GABAA受体激动剂muscimol对泌乳相关基因表达的影响54-55
• 2 实验结果55-64
• 2.1 不同浓度GABA处理对水牛乳腺上皮细胞增殖的影响55-56
• 2.2 添加不同浓度GABAA受体激动剂muscimol对水牛乳腺细胞增殖的影响56-57
• 2.3 50μm/LGABA和不同浓度GABAA受体激动剂muscimol联合处理对水牛乳腺细胞增殖的影响57-58
• 2.4 不同浓度GABA处理对水牛乳腺上皮细胞周期的影响58-59
• 2.5 不同浓度的GABAA受体激动剂muscimol处理对水牛乳腺上皮细胞周期的影响59-60
• 2.6 50μm/LGABA和不同浓度的GABAA受体激动剂muscimol联合处理对水牛乳腺上皮细胞周期的影响60-61
• 2.7 不同浓度GABA及muscimol处理对乳腺上皮细胞周期蛋白CyclinD1的影响61-62
• 2.8 不同浓度GABA以及muscimol处理对乳腺上皮细胞泌乳相关基因表达的影响62-64
• 3 分析与讨论64-65
• 4 小结65-66
• 全文总结66-67
• 参考文献67-72
• 致谢72-73
• 硕士期间发表的文章73

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1 郝文艳;GABRP对水牛乳腺上皮细胞增殖以及泌乳相关基因表达的影响[D];广西大学;2016年

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本文编号：538837